1，25—（OH）2—D3对进展性肾炎大鼠肾小管间质胶原蛋白Ⅲ表达的影响
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作者: 林建明等
[摘要] 目的 探讨1，25-（OH）2-D3对进展性肾炎大鼠肾小管间质胶原蛋白Ⅲ（ColⅢ）表达的影响。 方法 将实验动物按随机数字表法分为3组（n=7）：假手术组（对照组）、进展性肾炎组（模型组）、6 ng/（100 g·d） 1，25-（OH）2-D3干预组（治疗组）。除对照组外，其余组均采用右肾切除并2次注射IgG（OX-7）鼠抗人Thy1.1单克隆抗体，制备进展性肾炎大鼠模型。1，25-（OH）2-D3干预8周后，检测各组大鼠24 h尿蛋白、血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）及电解质的变化，Masson染色观察肾组织病理改变。免疫组织化学检测肾小管间质ColⅢ的表达。 结果 与模型组比较，1，25-（OH）2-D3治疗不仅使大鼠24 h尿蛋白及BUN均明显降低（P<0.05），还能使ColⅢ表达显著下调（P<0.05）。肾组织病理损害明显减轻。 结论 1，25-（OH）2-D3可能通过明显降低进展性肾炎大鼠肾小管间质ColⅢ的表达，减轻肾小管间质纤维化而发挥肾脏保护作用。
[关键词] 1，25-（OH）2-D3；ColⅢ；进展性肾炎；肾小管间质纤维化；大鼠
[中图分类号] R692.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（a）-0004-04
肾小管间质的细胞外基质过度沉积容易引起肾功能不全，常见于许多慢性肾脏疾病。间质胶原，尤其是Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原，通常作为肾组织基底膜的“脚手架”而普遍存在于肾脏中[1-2]。胶原及其相关分子在肾小管间质的积聚即可以定义为肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）。肾小管间质纤维化的病变程度严重影响了肾功能的正常运作。延缓或阻止肾小管间质纤维化的进展，可以预防慢性肾脏病的发生[3]。1，25-（OH）2-D3除调节钙磷代谢外，在调节各种生物过程（如免疫调节、细胞增殖和分化、抗纤维化、减少尿蛋白）中发挥至关重要的作用[4]。但是，1，25-（OH）2-D3对进展性肾炎肾小管间质纤维化的保护作用尚不完全清楚。本研究旨在探讨1，25-（OH）2-D3对进展性肾炎大鼠模型中RIF胶原蛋白Ⅲ（ColⅢ）表达的影响，并观察肾脏组织病理形态学的改变，便于进一步了解1，25-（OH）2-D3对进展性肾炎大鼠RIF的可能作用途径及影响机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1，25-（OH）2-D3购自美国Sigma公司，IgG（OX-7）鼠抗人Thy1.1单克隆抗体购于美国Neo Markers公司，大鼠ColⅢ免疫组织化学试剂盒购于武汉BOSTER生物工程有限公司。
1.2 仪器
全自动多功能生化分析仪（日本Hitachi公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）。
1.3 动物模型制备及分组
雄性SD大鼠（重庆腾鑫生物技术公司提供，二级）21只，体重（131.2±10.0） g。将21只大鼠按随机数字表法分为3组（n=7）：假手术组（对照组，只做肾包膜剥离，不予肾脏切除）、进展性肾炎组（模型组）、6 ng/（100 g·d） 1，25-（OH）2-D3干预组（治疗组），选用进展性肾炎模型参照参考文献[4]，行右肾摘除术，分别于术后第1、2周予尾静脉注射IgG（OX-7）鼠抗人Thy1.1单克隆抗体1.2 mg/（kg·d），共2次。1，25-（OH）2-D3干预组于术后予1，25-（OH）2-D3 6 ng/（100 g·d）入饮水中灌胃至8周。所有大鼠均于8周后处死，收集24 h尿液，取大鼠心脏血并制作肾组织标本。
1.4 观察指标与方法
1.4.1 24 h尿蛋白定量 处死大鼠前3 d，将大鼠放入代谢笼中收集24 h尿液，每只收集3次，用双缩脲法测定尿蛋白含量，求平均尿蛋白含量。
1.4.2 血生化检测 取大鼠心脏血清，测定血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、钙、磷等。
1.4.3 肾脏组织病理学检查 肾组织以10%甲醛固定并编号，石蜡包被，2 μm厚连续切片，Masson染色，光镜下观察肾脏病理改变。细胞核染黑蓝色，胶原纤维呈绿色，肌纤维、红细胞呈红色。
1.4.4 免疫组织化学法检测 ColⅢ蛋白的表达：取2 μm厚石蜡切片，常规脱蜡至水，灭活内原性酶，热修复抗原，抗原抗体反应，DAB显色、脱水、透明、封片、显微镜观察。操作步骤按试剂盒说明书进行。阳性产物呈深褐色，不加抗体为阴性对照。
1.4.5 免疫组织化学分析 采用显微图像分析系统（Olympus C3040-ADU）对各组染色结果进行积分光密度值（integral optical density，IOD）测定，每张切片随机选取10个高倍视野，每个视野代表0.13 mm2的区域面积，计算其IOD值，取平均值。
1.5 统计学方法
所得数据采用SPSS 18.0统计软件包进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，经方差齐性检验，再进行两独立样本均数t检验和组内的方差分析，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 1，25-（OH）2-D3对进展性肾炎大鼠24 h尿蛋白、肾功能的影响
术后8周，模型组24 h尿蛋白量、SCr和BUN均显著高于对照组（P<0.05）。经1，25-（OH）2-D3干预治疗后，与模型组比较，24 h尿蛋白量、BUN均显著降低（P<0.05），两组间SCr差异无统计学意义（P>0.05）。治疗前后电解质钙、磷水平在治疗组无明显变化（P>0.05）（表1）。
表1 3组大鼠各项检测指标的比较（x±s）
与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05 2.2 1，25-（OH）2-D3对肾组织病理变化的影响
Masson染色（图1）显示，对照组肾小管间质形态基本正常；模型组见肾小管上皮细胞萎缩、脱落，肾小管管腔扩张、间质胶原纤维增厚。与对照组比较，模型组间质炎症和纤维化进行性加重。与模型组比较，治疗组肾小管上皮细胞形态恢复正常，间质炎症得到改善，胶原纤维积聚减少。
2.3 1，25-（OH）2-D3对进展性肾炎大鼠肾间质ColⅢ蛋白表达的影响
ColⅢ蛋白表达主要集中于肾小管上皮细胞和间质细胞的胞质，模型组肾间质ColⅢ蛋白表达较对照组显著增多（P<0.01），应用1，25-（OH）2-D3治疗后，ColⅢ表达均较模型组明显减少（P<0.05）（图2）。
3 讨论
肾脏纤维化是一个常见的导致肾脏功能衰竭的终末事件。因此，了解肾脏纤维化的发生、发展过程对肾脏疾病的早期干预治疗有重大意义。近年来研究证实，一种活性维生素D3类似物——帕立骨化三醇可以减缓单侧输尿管结扎大鼠模型中间质纤维化、抑制肾小管上皮-间充质转化（EMT）[5]、改善肾脏炎症[6-7]，减少尿蛋白，抑制足细胞损伤[8]。因而，本研究观察了进展性肾炎1，25-（OH）2-D3通过抑制RIF ColⅢ的表达，发挥进展性肾炎抗纤维化的保护作用。
本研究中，Masson染色结果显示，模型组肾小管上皮细胞萎缩、脱落，肾小管管腔扩张、间质胶原纤维增厚，与对照组比较，模型组间质炎症和纤维化进行性加重，证实系膜增生性肾炎模型大鼠是目前观察进展性肾炎比较理想的动物模型[9-10]。生化指标显示，模型组24 h尿蛋白含量、SCr、BUN均较对照组明显升高，表明进展性肾炎的大鼠模型造模成功。在予以1，25-（OH）2-D3干预治疗后发现，与模型组相比，24 h尿蛋白含量及BUN均降低，提示1，25-（OH）2-D3可以减少进展性肾炎大鼠模型中的尿蛋白含量、抑制肾脏纤维化，提高肾脏功能。另外，本实验还监测了血电解质钙、磷的变化，发现在给予1，25-（OH）2-D3治疗前后，钙、磷无明显统计学差异，表明该1，25-（OH）2-D3的实验浓度[11]不会引起钙、磷代谢紊乱，从而干扰实验结果的准确性。
ColⅢ是肾组织基底膜的重要组成成分，对维持基底膜的完整性发挥重要作用[12]。ColⅢ表达的过多或过少均提示肾组织基底膜的结构及完整性发生了改变。在肾组织基底膜中，肾间质基底膜占其总量的85%～90%[13]。本研究中亦发现进展性肾炎大鼠模型肾间质组织中ColⅢ表达较对照组明显增加，而应用1，25-（OH）2-D3干预后，ColⅢ表达明显下降，进一步提示了1，25-（OH）2-D3可能通过ColⅢ表达减少，减轻RIF的发生、发展。本课题组前期实验发现，进展性肾炎大鼠模型肾间质组织中结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）表达增加，该因子又是公认的较强的促纤维化生长因子[14]，可促进细胞分泌细胞外基质，如ColⅢ[15]、纤连蛋白和整合素α5显著增加[16]，提示1，25-（OH）2-D3降低ColⅢ的表达可能通过抑制肾小管间质组织中CTGF的表达发挥作用。
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（收稿日期：2013-11-01 本文编辑：林利利）
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