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内源性神经肽对大鼠心肌缺血再灌注引起心肌损伤的影响

来源:用户上传      作者: 刘亚兵 郭政 郭建丽 贾晓鹰

  [摘要] 目的 研究内源性神经肽对大鼠心肌缺血再灌注引起心肌损伤的影响,探讨内源性神经激肽在心肌缺血再灌注损伤中的病理生理学作用。 方法 健康成年雄性SD大鼠40只,体重350~400 g,随机分为5组(n = 8):假手术组S(只穿线,不结扎冠状动脉)、缺血再灌注组IR(静脉给予生理盐水)、不同浓度[(10-11) mol/kg,(10-10) mol/Kg和(10-9) mol/kg]神经激肽-1(NK1)受体拮抗剂([D-Arg1,D-Phe5,D-Trp7,9,Leu11]-SubstanceP,D-SP)组。缺血再灌注组和各给药组均结扎冠状动脉左前降支30 min,然后松开结扎线再灌120 min,按1 μl/g剂量于再灌前5 min给药。用分光光度法检测各组Caspase-3活性;用TTC法及BI-2000医学图像分析系统测定缺血面积和梗死面积。 结果 1)和IR组相比,S组的Caspase-3活性降低(P < 0.05),D-SP10-10组升高24%(P < 0.01);(2)和IR组相比,各给药组的缺血面积略有增高(P > 0.05),和IR组相比,D-SP10-10组梗死面积显著增高(P < 0.01)。 结论 内源性神经肽在大鼠缺血再灌注损伤中可能发挥着抗凋亡及损伤,保护心肌的作用。
  [关键词] 心肌缺血再灌注;内源性神经肽;P物质; Caspase-3;梗死面积
  [中图分类号] R542.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2013)12-0015-03
  急性心肌梗死是常见的危重症之一[1],尽快有效的恢复血液灌流被认为是防治心肌缺血损伤的根本措施。然而,大多数研究表明心肌在恢复供血后不但不减轻或逆转损伤,反而加重损伤,且细胞凋亡可能是心肌缺血再灌注损伤发病机制的重要环节之一[2]。P物质(SP)是发现最早的一种神经肽,是神经激肽的代表物质,其分布广泛,参与机体多种功能的调节,尤其对心血管功能的影响。前期研究表明SP可通过调节心肌细胞PKA活性,抑制由NE诱导的细胞凋亡,对心肌具有保护作用[3]。本实验拟探讨内源性神经激肽对在体大鼠缺血再灌注所致的心肌损伤的影响。
  1 材料与方法
  1.1 药品与试剂
  1.2 实验方法
  1.2.2 分光光度法检测Caspase-3活性 各实验组均在再灌120 min末开胸,迅速取出大鼠心脏用冰生理盐水冲洗干净,取左室壁相同部分缺血区心肌组织置于EP管,液氮冷冻5 min后置于-70℃低温冰箱保存待测样品称重,按10 μL/mg加入裂解液,4℃高速离心后取上清,采用BCA法测定蛋白浓度,按照碧波Caspase-3活性分光光度法检测试剂盒说明检测各组Caspase-3活性。
  1.3 统计学处理
  采用SPSS 统计软件,数据均表示为均数±标准差(x±s),组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA),两组间比较采用t检验,P < 0.05 表示差异有统计学意义。
  2 结果
  3 讨论
  研究表明,心肌细胞凋亡参与了冠心痛、心律失常等心血管疾病的形成和发展过程,缺血再灌注损伤时心肌细胞凋亡也明显加重[4]。采用在体家兔心肌缺血再灌注模型发现,单纯缺血30 min、4.5 h和缺血5 min再灌注4 h的心肌细胞均未出现凋亡现象,而缺血30 min再灌注4 h的心肌细胞则出现了凋亡,因此认为凋亡是心肌对缺血再灌注损伤的一个特殊反应[5]。Caspase(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶)是一类在进化上非常保守的蛋白酶类,Caspase-3被认为是各种凋亡刺激因子激活的Caspase家族中的关键蛋白酶,与DNA断裂、染色体凝聚和凋亡小体形成有关,是直接介导凋亡的效应分子[6]。目前已证实Caspase-3是三条途径即细胞表面受体途径、线粒体途径、及内质网途径的最终主要激活凋亡效应酶[7],生理状态下,Caspase-3以无活性的酶原形式存在,凋亡信号可导致Caspase-3激活,活化的Caspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成,裂解相应的胞浆和胞核底物,最终导致细胞凋亡[8]。因此,Caspase-3活性测定成为凋亡相关研究的重要指标。
  SP作为一种神经肽,同时也是重要的神经递质/调质[9],参与了免疫调节、神经炎性反应等机体的各种调节,参与了心脏的病理或生理功能[10,11]。实验室前期研究表明SP可通过调节心肌细胞PKA活性,抑制由NE诱导的细胞凋亡且NK1受体参与介导SP的抗凋亡作用[3]。
  本实验结果显示,缺血再灌组Caspase-3活性高于假手术组,各给药组的Caspase-3活性均有高于缺血再灌注组的趋势,说明缺血再灌确实可导致细胞凋亡增加,这一结果与文献报道相一致,而对于SP在心肌缺血再灌注中发挥的作用,文献报道少有,本实验发现D-SP可引起心肌缺血再灌注细胞凋亡显著加剧,提示内源性神经肽可能在缺血再灌注损伤中可发挥抗凋亡,对心肌具有保护作用。
  正常心肌细胞含有脱氢酶,其在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid,NADH)存在的条件下可将无色的氧化型染料TTC还原成红色的还原型TTC,从而使活体心肌染色。梗死的心肌细胞因细胞膜损伤造成脱氢酶丢失,无法将氧化型TTC还原,故不能使心肌染色。据此可将存活心肌与梗死心肌加以分离[12,13]。心肌梗死面积扩大是心肌缺血再灌注损伤的一个重要特征,而梗死面积的多少决定着缺血再灌注对心肌损伤的严重程度[14-16]。
  本实验结果表明,和缺血再灌注组相比,三个浓度给药组心肌缺血面积均有升高趋势,但无统计学意义。而对于梗死面积,三个浓度给药组也均高于对照组,但只有D-SP10-10有统计学意义(P<0.01),说明D-SP可加剧心肌再灌注损伤,导致梗死面积扩大,D-SP10-10可能是最有效的浓度,提示内源性神经肽可能在缺血再灌损伤中具有抗损伤,保护心肌的作用。本实验观察到,各给药组的缺血面积均比缺血再灌组高,所以梗死面积的增加和缺血面积大有一定的关系。分析其原因一方面可能是主观因素,在实验过程中给药组结扎的缺血面积比较大。另一方面,研究表明SP能够引起人和犬的冠状动脉舒张,从而在心脏缺血情况下形成自我保护[17],给予D-SP后,冠脉血流量减少,导致缺血面积增加。   实验结果总体表明,D-SP可能会引起细胞凋亡,导致心肌梗死面积的增加,提示内源性神经肽在大鼠缺血再灌注损伤中可能发挥着抗损伤,保护心肌的作用,具体机制有待进一步研究和探讨。
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  (收稿日期:2013-03-13)
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