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左乙拉西坦在外伤性癫痫中神经保护的实验研究

  摘要:目的 观察左乙拉西坦急性期干预对大鼠外伤性癫痫的行为学、海马神经细胞凋亡与胶质细胞增生的影响。方法 三氯化铁皮层注射造模后,予以左乙拉西坦灌胃干预,将大鼠随机分为健康对照组、模型组及左乙拉西坦75 mg/kg剂量预防组(低剂量组)、150 mg/kg剂量预防组(中剂量组)、300 mg/kg剂量预防组(高剂量组)、600 mg/kg剂量预防组(极高剂量组)。观察各组大鼠造模7 d后的癫痫行为学改变;采用Fluoro Jade-C荧光技术进行海马CA3区凋亡神经元计数;造模后14 d采用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色观察海马CA3区胶质细胞增生。评价左乙拉西坦在大鼠外伤性癫痫急性期的海马神经保护作用。结果 与模型组比较,除低剂量组外,中、高、极高剂量组癫痫发作次数、神经细胞凋亡与胶质细胞增生计数差异均有统计学意义(P<0.05);与低剂量组比较,中、高、极高剂量组癫痫发作次数、神经细胞凋亡与胶质细胞增生计数差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 大鼠外伤性癫痫急性期进行左乙拉西坦干预可以减少癫痫发作,抑制海马神经元凋亡和胶质细胞增生,具有神经保护作用。
  关键词:外伤性癫痫;左乙拉西坦;三氯化铁;胶质细胞增生;神经细胞凋亡
  中图分类号:R742.1R259 文献标识码:A
  脑外伤后,含铁血黄素外渗沉积于神经纤维中,与人类痫性发作密切相关,三氯化铁皮层注射可良好地模拟这一致痫机制。左乙拉西坦是一种新型抗癫痫药物,通过与中枢神经的突触囊泡蛋白结合来调节神经递质的释放发挥抗痫作用。目前尚无左乙拉西坦在外伤性癫痫(posttraumatic epilepsy,PTE)急性期神经保护作用研究的相关报道。本实验观察左乙拉西坦在大鼠外伤性癫痫模型中对癫痫发作,海马神经元凋亡与胶质细胞增生的影响。
  1 材料与方法
  1.1 实验动物 成年SD雄性大鼠48只,清洁级,体重170 g~210 g。由山西医科大学动物中心提供,标准饲料为喂养,自由摄食水,自然光照射,换气通风。
  1.2 外伤癫痫模型制备 术前8 h禁食,以10%水合氯醛0.34 mL/kg腹腔注射,麻醉后固定于立体定位仪。切开头部皮肤,暴露颅骨于左侧前囟前2 mm,中线旁3 mm,牙钻钻孔,微量进样器抽取三氯化铁(美国Sigma公司)溶液10 μL(5.50 g三氯化铁溶于200 mL去离子水)进针至硬膜下2.0 mm,5 min缓慢注入皮层,之后停留3 min拔出针芯,观察无药物外渗后缝合皮肤。
  1.3 实验动物分组 48只大鼠随机分为健康对照组、模型控制组、左乙拉西坦低剂量预防组(低剂量组)、左乙拉西坦中剂量预防组(中剂量组)、左乙拉西坦高剂量预防组(高剂量组)、极高剂量预防组(极高剂量组)6组。健康对照组与模型对照组仅给予生理盐水灌胃,无药物干预。左乙拉西坦低、中、高、极高剂量预防组在大鼠清醒后分别予以75 mg/kg、150 mg/kg、300 mg/kg、600 mg/kg左乙拉西坦灌胃干预7 d,每日1次。
  1.4 方法
  1.4.1 行为学观察 观察大鼠造模后急性期7 d癫痫发作行为改变,痫性抽搐发作程度参照Racine[1]评估标准:0 级,无惊厥;1 级,闭眼、胡须动,口、鼻、面肌阵挛;2级,在1级基础上出现节律性点头;3 级,在2 级基础上出现前肢阵挛;4 级,在3 级基础上出现后肢站立;5 级,在4 级基础上出现跌倒发作。3级及以上发作为标准。白天观察,夜间视频监控,次日统计总数。
  1.4.2 病理学检测
  1.4.2.1 神经细胞凋亡检测 大鼠灌胃7 d后,以10%水合氯醛麻醉,剖胸暴露心脏,经左心室灌入生理盐水60 mL,4%多聚甲醛80 mL断头取脑,脑组织置于4%多聚甲醛4 ℃环境过夜,之后置于30%蔗糖溶液中沉底,取冠状位海马水平切15 μm冰冻切片。每只大鼠切5张切片,共6组。
  1.4.2.2 Fluoro Jade-C(FJ-C)染色 由美国AAT公司提供,具体步骤:切片室温复温30 min;蒸馏水浸洗2 min;切片浸于含1%NaOH的80%乙醇中5 min;70%乙醇中浸洗2 min;蒸馏水浸洗2 min;0.06%高锰酸钾中浸泡10 min;蒸馏水浸洗2 min;0.1%乙酸配制0.000 1%Fluoro Jade-C工作液(染色4 h内配制)浸泡反应20 min;蒸馏水浸洗3 min;将切片自然晾干,二甲苯透明;抗荧光衰减剂封片;在Olympus53荧光显微镜(蓝色滤光片)观察并采集图像。
  1.4.2.3 胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学染色 由武汉博士德公司提供,大鼠灌胃15 d后,经剖胸灌注生理盐水,4%多聚甲醛灌注取脑后石蜡包埋,取冠状位海马水平行切片5 μm冰冻切片,每组5张,共6组。经常规脱蜡至水,染色步骤逐步进行,中性树胶封片后光镜下观察。
  1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0对所得数据进行统计分析,所有数据用均数±标准差(x±s) 表示,进行单因素方差分析及LSD-t检验。以P<0.05有统计学意义。
  2 结 果
  2.1 行为学改变 本实验造模成功率为69.6%。大鼠清醒后至第1次癫痫发作时间为0 h~36 h。急性期癫痫发作呈现神情呆滞,阵发性凝视,之后出现自动症:点头、哈欠、弓背、后足站立、前肢抽搐和跌倒发作,持续时间15 s~40 s。持续状态发作时意识丧失,全身颤抖,尿失禁,持续时间2 min~6 min。发作间期无精打采、结膜充血、纳差进而消瘦,个别大鼠腹部腿毛,毛发无光泽,稀疏。进入慢性期后,表现为懒动、易激惹,受到刺激时烦躁不安,上蹿下跳,撕咬他鼠,可观察到2级以上的癫痫发作,时限不超过1 min。予以各剂量左乙拉西坦干预后,各组大鼠癫痫行为学均有改善,发作次数减少,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。以中、高、极高剂量组效果明显。详见表1。   2.2 病理学观察
  2.2.1 神经细胞凋亡 Fluoro Jade-C是一种阴离子荧光配体染料,可快速、可靠标记正发生变性坏死的脑神经元。本实验结果显示,健康对照组同侧海马CA3区FJ-C阳性细胞较少,模型组及左乙拉西坦干预组存在不同程度的FJ-C阳性细胞,提示癫痫发作后海马CA3区发生了大量神经元变性。左乙拉西坦各干预组和模型组比较,随左乙拉西坦剂量递增海马神经元凋亡数下降,以中、高、极高剂量组明显,提示左乙拉西坦可改善癫痫发作对脑细胞的损伤,具有神经保护作用。详见表2。
  2.2.2 胶质细胞增生 健康对照组同侧海马CA1区神经胶质细胞少量增生。模型组海马CA1区显示胶质细胞明显增多,胞体肿胀,密集分布锥体细胞两侧,胞体与树突染色阳性。左乙拉西坦低、中、高、极高剂量组CA1区胶质细胞增生数少于模型组,以左乙拉西坦高、极高剂量组明显,差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。
  3 讨 论
  皮层注射铁离子诱发癫痫可良好地模拟PTE患者的临床表现和病理研究证实的组织学改变[2]。癫痫发作导致海马神经细胞丢失、星形胶质细胞增生、海马齿状回颗粒细胞突触重建形成异常兴奋通路为晚期癫痫发生的病理基础[2-4]。左乙拉西坦通过作用于中枢神经的突触囊泡蛋白与其结合来调节神经递质的释放而发挥抗癫痫效用,对γ-氨基丁酸(GABA)能神经递质的抑制作用无促进作用,与兴奋性谷氨酸离子型受体无相互作用,在大脑内具有特定的膜结合位点,是作为阳性突触传递的调制器通过提高囊泡的分泌量来提高释放的概率[5];是唯一选择性结合突触小泡蛋白SV2A的抗癫痫药物,调控囊泡内递质释放,抑制谷氨酸盐的释放[6]。左乙拉西坦与SV2A在脑内有很高的亲和性,与抑制痫性放电密切相关[7]。既往资料显示,左乙拉西坦在戊四氮点燃的慢性癫痫模型中无抗抽搐作用[8],目前尚无应用左乙拉西坦在急性期外伤性癫痫的模型中对癫痫发作及相关神经元和胶质细胞影响的研究报道。本实验结果提示在外伤性癫痫急性期应用左乙拉西坦可明显减少癫痫发作,显著减少海马神经元凋亡和抑制胶质细胞增生,具有神经保护作用。
  PTE 后频繁的痫性发作引起海马缺血缺氧,随后的氧化应激反应可能诱导海马神经前体细胞的增殖分化,或者神经胶质细胞自身增殖,造成海马结构紊乱。在本实验PTE模型中可以见到CA3区神经元凋亡明显。每一次癫痫发作均会使脑组织缺血缺氧,使齿状回的中间神经元因缺氧出现水肿、变性甚至死亡,抑制性中间神经元的损伤,使癫痫发作的结果变成发作的原因,形成恶性循环[9]。以往资料表明,FJ- C可用于检测大脑皮质、海马、纹状体、黑质等神经元的变性坏死,标记不可逆损害的神经元[10,11]。国内学者证实,丙戊酸钠和左乙拉西坦均对戊四氮慢性致痫大鼠海马凋亡有抑制作用,是癫痫发作后对神经细胞有保护作用的抗癫痫药物;左乙拉西坦对戊四氮慢性致痫大鼠海马细胞凋亡的抑制作用较丙戊酸钠明显,提示左乙拉西坦有较好神经保护作用[8]。本实验中模型组海马神经元存在大量阳性FJ-C细胞,表明因癫痫反复发作致使神经元凋亡,急性期应用左乙拉西坦干预后,不同剂量组均显示不同程度的FJ-C阳性细胞数量下降,提示该药可以减少海马神经元的凋亡,具有神经保护作用。
  癫痫发作刺激GFAP表达增多,增生的胶质细胞易于凋亡,同时凋亡的胶质细胞会进一步损害周围的正常细胞,加重癫痫病理损害[12],癫痫发作急性期胶质细胞表现为水肿,7 d~14 d增生显著。磁共振波谱成像研究显示,伴有海马硬化的颞叶内侧癫痫的同侧顶叶N-乙酰天冬氨酸/(肌酸+胆碱)[NAA/(Cr+Cho)]降低,这也许是由于神经元丢失和神经胶质增生或神经元功能异常引起[13]。林元相[14]采用抗氧化剂干预外伤性癫痫动物模型,7 d后观察海马GFAP阳性表达细胞,结果表明左乙拉西坦阳性细胞数较模型组显著减少但比正常组增多。本实验中,脑外伤急性期应用不同剂量左乙拉西坦干预后,不同剂量组对胶质细胞增生数量均有抑制作用,说明脑外伤急性期应用左乙拉西坦可不同程度干预神经胶质细胞增生。
  本实验结果提示左乙拉西坦能够预防外伤性癫痫发生,减轻与癫痫发生有关的海马神经元损害与胶质纤维增生,为下一步临床应用左乙拉西坦干预外伤性癫痫发生提供可靠的实验依据。
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  (收稿日期:2014-08-08)
  (本文编辑郭怀印)


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