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黄芪―当归不同配伍比例对大鼠血管内膜增生的影响

  摘要:目的 �^察黄芪和当归不同比例配伍对大鼠血管内膜增生的影响,确立二者抗血管内膜增生的有效配伍。方法 采用基线等比设计方法将SD大鼠分为5个黄芪-当归不同配比组、单用黄芪组、单用当归组、阳性药组和假手术组,采用球囊导管损伤大鼠血管内皮造成胸腹主动脉血管内膜增生模型,同时灌胃黄芪、当归不同比例配伍药物,连续14 d,放血处死大鼠,取胸腹主动脉,行Masson染色,形态计量学方法分析血管内膜增生情况。结果 血管内膜损伤后14 d,胸腹主动脉内膜面积(IA)、内膜厚度(IT)、内膜面积增生率(HRIA)、内膜厚度增生率(HRIT)均增加。与模型组比较,单用当归组、芪归1∶2组、芪归1∶5组、芪归1∶1组、芪归5∶1组IA、IT、HRIA、HRIT均降低,且以芪归1∶1组作用最强。单用黄芪组、芪归2∶1组内膜增生各指标变化不明显。结论 黄芪和当归在一定比例范围配伍时具有抑制血管内膜增生的作用,其中以黄芪∶当归=1∶1配伍比例抗血管内膜增生的作用为佳。
  关键词:黄芪;当归;血管内膜增生;配伍比例;大鼠
  DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.014
  中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)06-0056-04
  Abstract: Objective To observe the effects of different compatibility ratios of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix on vascular intimal hyperplasia; To ascertain the effective compatibility of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix for antagonizing vascular intimal hyperplasia. Methods SD rats were divided into different groups by baseline geometric design method: Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix different compatibility ratios groups, Astragali Radix group, Angelicae Sinensis Radixgroup, positive medicinegroup and sham-operation group. A model of intimal hyperplasia of thoracoabdominal aorta was established by balloon catheter injury in vascular endothelium of rats. Then the thoracoabdominal aorta was taken out after gavage of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix with different compatibility ratios for 14 days. Bloodletting was used to take thoracoabdominal aorta. Masson staining and Morphometric methods were used to analyze the intimal hyperplasia. Results IA, IT, HRIA and HRIT increased 14 day after intimal injury. Compared with the model group, IA, IT, HRIA and HRIT in Angelicae Sinensis Radix group, Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix 1:2 group, Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix 1:5 group, Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix 1:1 group and Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix 5:1 group were lower, and the effects of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix 1:1 ratio were strongest. The effects on intimal hyperplasia in Astragali Radix group and Astragali Radix and Angelicae Sinensis 2:1 group had no significant differences compared with model group. Conclusion Astragali Radix and Angelicae Sinensis can inhibit vascular intimal hyperplasia in a certain compatibility ratios, and the effects of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix 1:1 on intimal hyperplasia are the best.
  Key words: Astragali Radix; Angelicae Sinensis; vascular intimal hyperplasia; compatibility ratio; rats   基金项目:国家自然科学基金青年基金(81473851);湖南省研究生科研创新项目(CX2016B378);中西结合临床湖南省“十二五”重点开放基金(ZXLCXK201504);湖南省科技创新团队(2013年);湖南省自然科学创新群体基金(2013年)
  通讯作者:邓常清,E-mail:dchangq@sohu.com
  黄芪和当归是临床常用的中药药对,二者配伍既可补气生血,又能益气活血,具有药理多效性。研究表明,由黄芪和当归配伍组方具有促进造血[1]、心血管保护作用[2]、抗动脉粥样硬化[3]等功效。但二者以何比例配伍将产生不同的药理效应?在不同的病证应如何配伍?上述问题均未阐明。因此,我们基于中药方剂配伍的理论,以黄芪和当归配伍益气活血功效为基础,以抗血管内膜增生为切入点,探讨黄芪和当归抗血管内膜增生的配伍关系,以期为临床合理应用提供实验依据。
  1 实验材料
  1.1 动物
  健康雄性SD大鼠135只,体质量220~250 g,SPF级,8周龄,湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物许可证号SCXK(湘)2013-0004。饲养于湖南中医药大学实验动物中心,湿度45%~65%、室温25 ℃,喂食标准词料,自由摄食饮水。
  1.2 药物
  黄芪、当归,湖南中医药大学附属第一医院药剂科提供,并经药剂科左亚杰教授鉴定,黄芪为膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge的干燥根,当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根。阿托伐他汀钙片,浙江新东港药业股份有限公司,批号20160803,10 mg/片。
  1.3 主要试剂与仪器
  Masson染色试剂盒,湖南中医药大学病理形态学实验室配制。U-TV0.5XC-3双目显微镜(日本奥林巴斯公司),Motic Images Plus 2.0ML图像采集系统(麦克奥迪实业集团公司),MIAS医学图像分析系�y(北航公司),PL203电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司),2.0 mm×15 mm Runjin医用球囊导管、Runthrough导丝和医用球囊扩张压力泵(日本泰尔茂株式会社)。
  2 实验方法
  2.1 药物制备
  依据2015年版《中华人民共和国药典》中黄芪用量为9~30 g、当归用量为6~12 g,取成人临床常用量黄芪为20 g、当归为10 g,黄芪-当归配伍成人临床常用量36 g(黄芪+当归),换算成大鼠等效剂量为黄芪2.17 g/kg、当归1.08 g/kg、黄芪-当归配伍3.9 g/kg。按不同配伍分别称取药材,以水热回流法提取3次(第1次8倍量水,提取1 h;第2、3次6倍量水,提取1 h),合并3次提取液,过滤,60 ℃真空减压浓缩得浸膏,配制药物浓度为含原药材黄芪0.22 g/mL、当归0.11 g/mL、黄芪-当归不同比例配伍0.39 g/mL。在药液中加入0.1%苯甲酸钠,分装后置于-4 ℃冰箱保存备用。灌胃时按大鼠每100 g体质量灌胃1 mL药液。
  2.2 分组及给药
  大鼠采用基线等比设计方法[4]分组,每组8只。将芪归比5∶1设为配比基线,黄芪和当归用量以16.6%向两侧递增或递减[5]:芪归5∶1组(黄芪3.25 g/kg+当归0.65 g/kg)、芪归2∶1组(黄芪2.6 g/kg+当归1.3 g/kg)、芪归1∶1组(黄芪1.95 g/kg+当归1.95 g/kg)、芪归1∶2组(黄芪1.3 g/kg+当归2.6 g/kg)、芪归1∶5组(黄芪0.65 g/kg+当归3.25 g/kg)。另设单用黄芪组(2.17 g/kg)、单用当归组(1.08 g/kg)、阳性药组(阿托伐他汀10 mg/kg)。
  2.3 造模
  大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 mL/100 g),仰卧位固定。颈部剪毛及消毒后,取颈正中稍偏左位置切开,分离出左颈总动脉。结扎左颈总动脉远心端,动脉夹夹闭其近心端,随后稍靠血管远心端做一V形切口。取出球囊导管,将导管球囊部在生理盐水中洗净,保持导丝尖端与球囊部尖端平齐,并用医用缝线结扎固定导丝与球囊导管使其不能相互滑动,将球囊扩张压力泵回抽使球囊内呈负压状态,从切口插入后,松除动脉夹,随后继续小心插入越过主动脉弓至深度约6~7 cm处。用医用球囊扩张压力泵加压充盈球囊,加压并保持压力为8 bar,来回反复拖拉球囊导管至主动脉弓处4次(球囊拖出至主动脉弓再插入至6~7 cm处记为1次)。然后转动球囊导管180°后再进行4次同样操作。完成后将球囊扩张压力泵回抽至负压状态后撤出导管,结扎远心端,在伤口处撒适量庆大霉素缝合伤口。从造模当日开始,每日肌注青霉素20万U,连续3 d,以预防感染。术后第1日开始分别灌胃不同药液,连续14 d后检测。
  2.4 血管内膜增生指标测定
  采用我们以往建立的血管形态计量学方法[6]进行检测。将大鼠麻醉后放血处死,打开腹腔和胸腔,截取胸腹主动脉,洗净,剥去血管外结缔组织,4%多聚甲醛固定24 h,梯度乙醇脱水,石蜡包埋,每段血管间断均匀切取8片后行Masson染色。切片脱蜡至水,苏木素染色5 min,水洗,促蓝;丽春红酸性品红液染色5~10 min;0.5%冰醋酸水溶液0.5~1 min,水洗;1%磷钼酸水溶液分色3~5 min;0.5%冰醋酸水溶液30 s;1%亮绿水溶液10 s;0.5%冰醋酸水溶液中分色30 s,水洗;自然晾干封片。镜下观察,拍照,用Image-Proplus6.0图像分析软件测量中膜中线周长、中膜面积(MA)、内膜中线周长、内膜面积(IA),计算出中膜厚度(MT,MA÷中膜中线周长),内膜厚度(IT,IA÷内膜中线周长),内膜面积增生比率[HRIA,IA÷(IA+MA)×100%]、内膜厚度增生比率[HRIT,IT÷(IT+MT)×100%]。   3 统计学方法
  采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以―x±s表示,多组间均数比较采用方差分析,方差齐用LSD检验,方差不齐用Dunnet'T3检验。P<0.05表示差异有统计意义。应用单因素模糊评判方法进行分析。首先确定参评因素集X=(x1,x2,…,xm)和评判集Y=(y1,y2,…,ym),若贴近度Cj(Yj,X)为n个模糊集Y1,Y2,…,Yn与X贴近度中的最大者,则认为Yj与X最贴近。
  4 结果
  4.1 黄芪和当归不同配伍比例对模型大鼠血管内膜病理形态的影响
  假手术组大鼠血管内膜内弹力膜完整,呈单层,未见增生;模型组血管新生内膜呈均一或不均一增厚,大量增生血管平滑肌细胞(VSMC)存在,排列紊乱,管腔呈向心性或偏心性狭窄,内膜增生明显;单用黄芪组与芪归2∶1组血管内膜增生改变同模型组;单用当归组、芪归1∶5、1∶2、1∶1、5∶1组和阳性药组血管内膜呈增生性改变,但增生程度较模型组减轻。结果见图1。
  4.2 黄芪和当归不同配伍比例对模型大鼠血管内膜增生指标的影响
  与假手术组比较,模型组血管IA、IT、HRIA、HRIT均显著增加(P<0.01);与模型组比较,阳性药组、单用当归组及芪归1∶1、1∶2、1∶5、5∶1组血管组织IA、IT、HRIA、HRIT均显著减小(P<0.05,P<0.01);与阳性药组比较,单用当归组及芪归1∶1、1∶2、1∶5、5∶1组IA、IT、HRIA、HRIT均无显著差异(P>0.05),单用黄芪组及芪归2:1组IA、IT、HRIA、HRIT显著高于阳性药组(P<0.05,P<0.01)。芪归1∶1组IA、IT、HRIA、HRIT降低最为显著。结果见表1。
  4.3 单因素模糊评判结果
  芪归1∶1药物组与阳性药组贴近度C值最高,疗效较好,其中芪归1∶1组最为显著。单用黄芪组与芪归2∶1组贴近度C值相同且在各药物组中最低;单用当归组、芪归1∶2组、芪归1∶5组、芪归5∶1组贴近度C值居中。表明单用黄芪组及芪归2∶1组抗大鼠血管内膜增生作用不明显,单用当归组、芪归1∶2组、芪归1∶5组、芪归5∶1组均可抗血管内膜增生,其中芪归1∶1组作用最强。结果见表2。
  5 讨论
  黄芪味甘而薄,具补气之功。当归味甘而重,故专能补血;其气轻而辛,故又能行血,补中有动,行中有补。黄芪和当归配伍应用最有代表的是李东垣所创的当归补血汤,由黄芪一两、当归二钱组成,芪归比为5∶1。此后,黄芪与当归配伍比例复方有《血证论》《寿世保元》为2∶1,《医学心悟》为8∶2,《外科理例》为6∶1,《东医宝鉴》为5∶2,《产科心法》《医部全录》为10∶3。虽然其配伍比例不同,但均以治疗气虚发热为主[7]。由于血管内膜增生是动脉粥样硬化、血管成形术后血管再狭窄的主要病理基础,多属于“血瘀”范畴。因此,合理的芪归配伍可能对血管内膜增生有防治作用。
  本研究采用适用于效应明确的中药小复方(或药对)配比优化筛选的实验设计法基线等比增减法,以经典的芪归5∶1配伍为基线,采用向两侧递增或递减确定其不同的配伍比例范围[5]。这种设计方法能较好地分析出药物在不同剂量配伍下效应的区别。并且采用了模糊综合评判分析方法,进一步明确了不同配伍之间的疗效关系:单用当归及芪归以1∶1、1∶2、1∶5、5∶1配伍均有抗血管内膜增生的作用,且以芪归1∶1配伍疗效最佳,但单用黄芪及芪归以2∶1配伍抗血管内膜增生作用不显著。说明采用基线等比增减法进行实验设计与统计分析能较好地评价药物配伍效应的差别。
  血管内膜增生的关键原因是VSMC过度增殖[8]。有研究发现,大鼠动脉球囊损伤后几小时新生内膜中即出现VSMC增殖,7 d后增殖的VSMC移行至内膜,14 d后VSMC增加3~5倍,占增生内膜细胞总数90%[9]。本课题组研究发现,阿托伐他汀可使血管IA、IT、HRIA、HRIT显著降低,提示其可抑制血管内皮损伤后由于VSMC增殖导致的血管内膜增生。本实验结果表明,在黄芪和当归配伍抗血管内膜增生的作用中,当归的作用占主导地位,黄芪和当归在一定的比例范围内配伍时具有良好的抗血管内膜增生作用,且以芪归1∶1配伍比例效果最佳。提示临床应用黄芪和当归配伍治疗血管增殖性病变时,应选择合理的配伍比例,其作用机制有待进一步研究。
  参考文献:
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  (收稿日期:2016-11-11;�辑:华强)


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