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丹参水提物吸湿性及其成分初步研究

  摘要:目的 探索丹参水提物浸膏的吸湿性及其相关成分。方法 分别对丹参水提物及其大孔树脂吸附分离的水、醇洗脱部位浸膏的吸湿性进行测定,并对其所含低分子糖类(单糖-低聚糖)、多糖、蛋白质、氨基酸、鞣质及丹酚酸B等进行分析。结果 采用D101型大孔树脂分离纯化后,丹参水提物的水洗脱部位吸湿性增强,糖类、蛋白质等亲水性物质含量明显增加,丹酚酸含量降低至1.76 mg/g;醇洗脱部位的吸湿性及亲水性物质的含量明显降低,丹酚酸B含量增至146.57 mg/g。结论 丹参水提物浸膏的吸湿性与其所含低分子糖类等亲水性强的成分密切相关。D101型大孔树脂分离纯化丹参水提物不但可有效富集其所含酚酸类有效成分,而且可大幅降低浸膏得率与浸膏的吸湿性。
  关键词:丹参水提物;吸湿性;糖类;大孔树脂;丹酚酸B
  DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.020
  中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2017)06-0079-04
  Abstract: Objective To explore the moisture absorption and related components of aqueous extract of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma. Methods The hygroscopicity of aqueous extract of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma and its water and alcohol elution parts separated by macroporous resin was measured, and the contained low molecular sugars (monosaccharides, oligosaccharide), polysaccharide, protein, amino acid, tannins and salvianolic acid B, etc. were analyzed. Results D101 macroporous resin was used for separation and purification of aqueous extract of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma. The hygroscopicity of water elution parts was enhanced; carbohydrate, protein and other hydrophilic substances content increased; the content of salvianolic acid B was reduced to 1.76 mg/g. While the hygroscopicity and hydrophilic substances of alcohol elution parts were greatly reduced; the content of salvianolic acid B increased to 146.57 mg/g. Conclusion The hygroscopicity of aqueous extract of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizomais closely related to the contained strong hydrophilic components, such as low molecular sugars, etc. Using D101 macroporous resin to purify aqueous extract of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma can not only effectively gather the contain phenolic acids active ingredients, but also sharply decrease the extract yield and extract moisture absorption.
  Key words: aqueous extract of Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma; hygroscopicity; saccharides; macroporous resin; salvianolic acid B
  丹�⑽�唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎,用于胸痹心痛、心烦不眠、月经不调等病症。丹参中含有酚酸类水溶性有效成分,其中丹酚酸B为其主要成分,具有抗动脉粥样硬化的作用[1]。目前临床与中药生产中多以水为溶剂对中药进行提取,然而水提物中通常含有较多亲水性强的成
  分,导致中药浸膏吸湿而影响中药制剂的制备与质量。为探索中药浸膏吸湿性的物质基础并寻找解决该问题的方法,本研究以丹参水提物为对象,采用D101型大孔树脂对其进行分离纯化获得水洗脱部位与80%乙醇洗脱部位[2],然后分别对丹参水提物及其不同洗脱部位浸膏的吸湿性与相关成分(包括单糖-低聚糖、多糖、鞣质、丹酚酸B等)进行研究。
  1 仪器与试药
  电子天平(YP601N,上海恒平科学仪器有限公司),紫外可见分光光度计(T9CS,北京普析通用仪器公司),Agilent1260高效液相色谱仪,BDS HYPERSIL C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 ?m),数控超声清洗器(KQ5200BE型,昆山市超声仪器有限公司)。   丹参饮片(安徽惠隆中药饮片有限公司,批号20101114),丹酚酸B(四川省维克奇生物科技有限公司,批号115939-25-8),D101型大孔吸附树脂(天津市骨胶厂),乙腈(SK chemicals公司,色谱纯),甲醇(SK chemicals公司,色谱纯),冰醋酸(湖南汇虹试剂有限公司,分析纯),水为怡宝公司纯净水,水合茚三酮试剂(上海山浦化工有限公司,分析纯),苯酚(湖南汇虹试剂有限公司,分析纯),牛血清白蛋白(进口分装,Sigma公司),考马斯亮蓝G-250(天津光复精细化工研究所,分析纯),浓硫酸(株洲市星空化玻有限责任公司,分析纯),95%乙醇(湖南汇虹试剂有限公司,分析纯),磷酸二氢钾(长沙江龙化工科技有限公司,分析纯),氢氧化钠(湖南汇虹试剂有限公司,分析纯),EDTA(湖南汇虹试剂有限公司,分析纯),铬黑T(天津市科密欧化学试剂有限公司,分析纯),乙酸锌(天津市科密欧化学试剂有限公司,分析纯)。
  2 方法与结果
  2.1 丹参水提物及其大孔树脂吸附分离部位的制备
  2.1.1 丹参水提物的制备 称取丹参饮片1000 g,加水提取2次,加水量为10、8倍量,煎煮时间为2、1.5 h,合并2次提取液,减压浓缩,于(70±1)℃真空干燥,即得(浸膏得率为22.87%)。
  2.1.2 丹参水提物的分离 取丹参水提物浸膏9 g,精密称定,适量蒸馏水溶解,加入D101型大孔树脂柱,静态吸附24 h。用蒸馏水、80%乙醇洗脱,收集洗脱液,减压浓缩后于(70±1)℃真空干燥,得丹参大孔树脂水洗脱部位和丹参大孔树脂80%乙醇洗脱部位(以丹参原药材计,浸膏得率分别为14.43%和4.30%)。
  2.2 丹参水提物及其不同洗脱部位相关指标测定
  2.2.1 吸湿百分率的测定 取丹参水提物、丹参大孔树脂水洗脱部位及醇洗脱部位浸膏粉(过4号筛)平铺于已恒重的称量瓶中(厚度约1.8 mm),置装有氯化钠过饱和溶液的干燥器[预先在(25±1)℃饱和48 h]中,称量瓶敞开,将干燥器置于25 ℃恒温培养箱中(相对湿度为75%),分别于2、6、12、24、36、48、60、72、84 h时称重称量瓶,计算吸湿百分率,绘制吸湿曲线[3]。结果表明,丹参水提物的吸湿性显著低于丹参水洗脱部位的吸湿性,且明显大于丹参乙醇洗脱部位的吸湿性,见图1。
  2.2.2 总多糖、单糖-低聚糖含量测定
  2.2.2.1 对照品溶液的制备 取无水葡萄糖,加水溶解并定容,即得每1 mL含0.09 mg葡萄糖的对照品溶液。
  2.2.2.2 标准曲线的绘制 吸取对照品溶液0.10、0.40、0.80、1.20、1.50 mL,置�管中,加水至2.00 mL,以相应溶剂为空白,分别加入苯酚,振摇,加入浓硫酸,水浴加热一段时间,冷却,用紫外分光光度计在488 nm处测定[4],以浓度(?g/mL)为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程Y=0.008 4X+0.000 2,r2=0.999 3,表明葡萄糖在18~90 ?g/mL范围内线性良好。
  2.2.2.3 单糖-低聚糖供试品溶液制备与测定 取丹参水提物、丹参大孔树脂水洗脱部位与醇洗脱部位浸膏粉(过4号筛)各2.0 g,加水溶解、定容至25 mL,取适量溶解液,加乙醇至含醇量80%,静置48 h,过滤,取上清液,得单糖-低聚糖供试品。精密吸取供试品溶液2.00 mL,按“2.2.2.2”项下方法测定吸光度,分别计算各供试品中单糖-低聚糖相对于丹参生药的百分含量。
  2.2.2.4 总多糖供试品溶液制备与测定 精密称取丹参水提物、丹参大孔树脂水洗脱部位与醇洗脱部位浸膏粉(过4号筛)各0.5 g,置50 mL容量瓶中,加水溶解、定容,吸取0.05 mL于50 mL容量瓶国,定容,即得总糖供试品溶液。精密吸取供试品溶液2.00 mL,按上述方法测定。总多糖量=总糖量-单糖-低聚糖量[5]。
  2.2.3 蛋白质含量测定
  2.2.3.1 对照品溶液的制备 取牛血清白蛋白,加水溶解、定容(1 mL对照品含牛血清白蛋白0.1 mg)。
  2.2.3.2 标准曲线的绘制 吸取对照品0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL,置试管中,加水稀释至2 mL,加考马斯亮蓝染色液适量,于UV波长591 nm处测定[6],对照品浓度(?g/mL)为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程Y=0.006 3X+0.056 1,r?=0.994 5,表明在12~60 ?g/mL范围内线性关系良好。
  2.2.3.3 蛋白质供试品溶液的制备与测定 分别精密称取丹参水提物、丹参大孔树脂水洗脱部位与醇洗脱部位浸膏粉(过4号筛)各500 g,置50 mL容量瓶中,加水溶解、定容,吸取5.00 mL,用水稀释定容至50 mL,得供试品溶液。精密吸取供试品溶液2.00 mL,按“2.2.3.2”项下方法测定,计算蛋白质含量。
  2.2.4 氨基酸含量测定
  2.2.4.1 对照品溶液的制备 精密称定精氨酸适量,加水制成每1 mL含0.2 mg精氨酸的溶液,即得。
  2.2.4.2 标准曲线的绘制 吸取精氨酸对照品溶液0.00、1.30、1.60、1.90、2.20、2.50、2.80 mL,置试管中,加水至5.0 mL,加入2%茚三酮溶液1.5 mL、磷酸缓冲液(pH 6.8)1.5 mL,摇匀,置沸水中加热18 min,取出,置冰水中迅速冷却15 min,以水为空白,在紫外分光光度仪567 nm处测定吸光度[7],得回归方程A=0.002 1C-0.276 5,r?=0.999 1,表明精氨酸在43.3~93.3 ?g/mL范围内线性良好。   2.2.4.3 氨基酸供试品溶液的制备与测定 精密称取丹参水提物、丹参大孔树脂水洗脱部位与醇洗脱部位浸膏粉(过4号筛)各0.5 g,用水稀释至50 mL,精密吸取5.00 mL于容量瓶中,加水至50 mL,得供试品溶液。精密吸取供试品溶液4.00 mL,按“2.2.4.2”项下方法测定,计算氨基酸含量。
  2.2.5 鞣质含量测定 采用络合物返滴定法,依次称取丹参水提物、丹参大孔树脂水洗脱部位与醇洗脱部位浸膏粉(过4号筛)各50 mg,置25 mL容量瓶中,加蒸馏水,(37±1)℃水浴17 min。精密量取乙酸锌溶液适量,精密加入浓氨水0.90 mL,振摇2 min,使白色沉淀溶解,置于(37±1)℃水浴继续温热30 min,间歇振摇几次,冷却至室温,加蒸馏水定容,过滤,收集滤液,弃去初滤液,精密取续滤液25 mL,加入铬黑T试剂数滴,用EDTA-2Na滴定,溶液由紫红色变为蓝色,且1 min内不变色[8],计算鞣质含量。鞣质(%)=0.156 5×F(V0-V)M×20/W×100%。式中:F为校正因子,0.156 5为络合返滴定法中乙酸锌标准液相当于鞣质的比例常数,V0为空白滴定消耗的EDTA-2Na体积,V为样品滴定消耗的EDTA-2Na体积,M为EDTA-2Na标准溶液的摩尔浓度,W为对应的浸膏粉质量。
  2.2.6 指标成分含量测定结果(见表1)
  2.2.7 丹酚酸B含量测定
  2.2.7.1 色谱条件 色谱柱为BDS HYPERSIL C18(250 mm×4.6 mm,5 ?m),流动相为乙腈-甲醇-1.5%甲酸水(10∶30∶60),流速1 mL/min,柱温25 ℃,检测波长286 nm[9]。
  2.2.7.2 对照品溶液的制备 取丹酚酸B适量,加75%甲醇制成浓度为0.15 mg/mL的对照品溶液。
  2.2.7.3 标准曲线的绘制 精密吸取上述对照品溶液1、6、11、16、21 ?L,依次注入高效液相色谱仪。以丹酚酸B进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程Y=1082X+51.63,r2=0.999 0,结果表明,丹酚酸B在0.14~2.94 ?g范围内线性关系良好。
  2.2.7.4 供试品溶液的制备与测定 精密称取丹参水提物、丹参大孔树脂水洗脱部位与醇洗脱部位浸膏粉(过4号筛)各0.4 g,精密加入75%甲醇100 mL,称定质量,(79±1)℃加热回流2 h,放冷,再次称定质量,用75%甲醇补足减失的质量,摇匀,过滤,取续滤液。分别进液相色谱仪,计算。结果丹参水提物及其水洗脱部位、醇洗脱部位中丹酚酸B的含量分别为37.03、1.76、146.57 mg/g。
  2.2.8 丹参水提物及其不同洗脱部位HPLC图谱比较 采用BDS HYPERSIL C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 ?m);流动相为乙腈-1%冰醋酸水,乙腈体积分数在58 min内由0%线性增加到64%;流速1 mL/min;柱温25 ℃;检测波长254 nm[10];进样量20 ?L。精密吸取“2.2.6”项下对照品溶液与供试品溶液,依次注入液相色谱仪。结果表明,丹参水提物经大孔树脂处理后,其水洗脱部位除可见很弱的丹酚酸B峰外,几乎检不出其他成分色谱峰;醇洗脱部位的色谱峰与丹参水提物一致且色谱峰更强,说明丹参醇洗脱部位可基本保留丹参水提物中的酚酸类有效成分(见图2)。
  3 讨论
  丹参水提物浸膏具有一定的吸湿性,采用D101型大孔吸附树脂对其进行处理后,其水洗脱部位的吸湿性明显增强,而醇洗脱部位的吸湿性则明显降低,说明丹参水提物浸膏的吸湿性主要由丹参中的亲水性(或极性)强的成分引起,这类成分不易被非极性的D101型树脂所吸附而易被水洗脱。
  对丹参水提物及其不同洗脱部位浸膏的亲水性成分进行分析,结果表明丹参水提物有较高含量的低分子糖类成分(单糖-低聚糖),并含有一定量的多糖、蛋白质、氨基酸和少量的鞣质,其吸湿性可能与这些亲水性成分有关;水洗脱部位所含单糖-低聚糖、多糖、氨基酸和鞣质明显高于醇洗脱部位,其吸湿性亦显著大于醇洗脱部位,进一步表明上述成分可能是丹参水提物及其水洗脱部位吸湿性的主要物质基础。
  丹参水提物经D101型大孔树脂纯化处理后,其所含丹酚酸B主要保存在醇洗脱部位浸膏中,而在水洗脱部位浸膏中的含量则很低。丹参水提物及其不同洗脱部位的HPLC图谱比较亦表明,丹参水提物中所含酚酸类有效成分几乎均保存在醇洗脱部位浸膏中。另外,丹参水提物的浸膏得率约为23%,而经D101型大孔树脂纯化处理后所得醇洗脱部位的浸膏得率仅为4.3%。因此,采用D101大孔树脂纯化处理丹参水提物,不但可有效地富集丹参水提物中的酚酸类有效成分,而且可大幅度减少浸膏得率,并明显降低浸膏的吸湿性。
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  (收稿日期:2016-12-26)
  (修回日期:2017-01-12;编辑:陈静)


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