利用SSR标记分析木薯遗传多样性

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　　摘 要 应用简单重复序列（SSR）标记对国家木薯种质资源圃195 份国内（外）品种（系）进行遗传多样性分析。结果表明：44对引物共扩增出186个等位基因，每对引物平均扩增出2～8个等位基因，平均Shannon's信息指数I为1.01，平均多态性信息量（PIC）为0.49。195个品种（系）的遗传相似系数（GS）分布在0.57～0.99。聚类分析结果表明，在遗传距离0.71处，可将供试材料分为7个类群。
　　关键词 木薯 ；SSR标记 ；遗传多样性 ；聚类分析
　　分类号 S533
　　Genetic Diversity of Cassava Germplasm Revealed by SSR Markers
　　WANG Ming XIAO Xinhui AN Feifei WAN Zhongqing
　　YING Dongshan WANG Qinfei ZHANG Rulian LI Kaimian YE Jianqiu
　　（Tropical Crops Genetic Resources Institute /
　　Ministry of Agriculture Key Laboratory for Germplasm Resources Conservation
　　and Utilization of Cassava / Ministry of Agriculture Key Laboratory of
　　Tropical Crops Germplasm Resources Utilization， CATAS， Danzhou， Hainan 571737）
　　Abstract Using simple sequence repeat （SSR） markers 195 domestic（foreign）varieties（lines） on the National Cassava Germplasm Resources Garden were analyzed for genetic diversity. The results showed that 44 pairs of primers amplified 186 alleles with 2-8 alleles amplified by each pair of primers. The average Shannon 's information index was 1.01， and the average PIC is 0.49. The （GS） distributions on the genetic similarity coefficient of 195 varieties （lines） were 0.57～0.99. Cluster analysis results showed that 195 germplasms can be divided into 7 groups while the genetic distance was 0.71.
　　Keywords cassava ； SSR marker ； genetic diversity ； cluster analysis
　　木薯（Manihot esculenta Crantz）又称树薯，是世界三大薯类作物之一。19世纪20年代引入中国，原来作为粮食作物，具有高产、抗逆和块根淀粉含量高的特点。木薯已经被确认为中国“十一五”规划中能源发展战略重点发展的生物能源作物之一，是淀粉和酒精加工业的主要原料[1]。木薯是一种高度杂合的作物，这种杂合性带来了丰富的遗传变异性，为木薯育种提供了良好的选择机会[2]。木薯杂交育种主要是从2个优势亲本的杂种后代中选出理想的重组类型，需对大量的F1单株进行选育。因此，对木薯品种（系）的遗传多样性进行分析，可克服杂交时亲本的盲目组合，客观、全面地了解当前木薯育种的现状和种质基础，为杂交育种和定向育种提供支撑。
　　目前，分析木薯遗传多样性的分子标记主要有SRAP[3-4]、SSR[5-9]、AFLP[10]等方法。SSR分子标记具有重复性高、可靠性强且品种间多态性丰富等优点，并已广泛应用于玉米、水稻、大豆等作物的遗传图谱构建、遗传多样性分析和品种鉴定[11-13]。由于木薯为异花授粉植物，且基因型高度杂合，因此，使用具有共显性特点的SSR标记对其进行品种鉴定比其它作物具有明显优势。本研究对包括国内选育品种、地方品种、品系（育种中间材料）和引进国外品种（系）共195份木薯种质行遗传多样性分析。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　试验所用195份木薯材料均采集于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所-国家木薯种质资源圃，其材料名称、类型及来源见表1。
　　1.2 方法
　　1.2.1 总DNA的提取
　　每份材料随机选取5株，每株剪取1片小嫩叶，将样品混匀，带回实验室贮存于-20℃冰箱备用。采用CTAB改良法提取叶片的基因组DNA。
　　1.2.2 标记来源
　　根据文献报道的木薯SSR研究结果[14]，设计160对SSR引物，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
　　1.2.3 SSR标记多态性检测
　　SSR-PCR扩增反应总体系为20 μL，其中包含10×Buffer（含Mg2+）2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.4 μL、ddH2O 14.6 μL、引物各0.8 μL、Taq酶0.4 μL、木薯基因组DNA 3 μL。扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，32个循环；72℃充分延伸10 min，4℃保存。PCR扩增产物经6%聚丙烯酰氨凝胶电泳，硝酸银染色，照相。 　　1.2.4 数据统计及处理
　　SSR引物扩增到所有差异谱带，按扩增片段从大到小的顺序编号，纯合位点的等位变异数据记录为X/X，其中X为该位点谱带的代码；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上2个不同的谱带。小片段在前，大片段在后。用Popgene观察等位基因数（Na）、计算有效等位基因数（Ne）、遗传多样性（GD）和Shannon's信息指数（I）[15]。利用Ntsys分析软件进行遗传相似性系数计算，并按UPGMA法进行聚类分析[16]。利用Powermarker软件计算SSR 位点的多态性信息量（PIC）。PIC=1-∑Pi2，其中Pi表示i位点的基因频率[17]。
　　2 结果与分析
　　2.1 引物多态性筛选
　　利用4份木薯资源对160对引物进行筛选，共筛选出44对具有多态性好且扩增条带清晰的引物。利用44对引物对195份木薯材料进行PCR扩增，结果表明，共产生等位基因数为186个，每对引物产生等位基因数为2～8个，平均数为4.23个；C39扩增出的等位基因最多，共有8个等位基因；44对SSR引物平均有效等位基因数为2.53个，变异范围为1.30～4.69个；平均Shannon's 信息指数I为1.01；44对引物的基因多样性变幅为0.20～0.76，平均值为0.56，其中引物C24的多态性最高为0.76；44对引物的PIC值变幅为0.23～0.79，平均值为0.49，所有引物中PIC值小于0.3的有4个，其中C32的多态性最低，PIC值仅为0.20（表2）。SSR分子标记引物C124扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱见图1。
　　2.2 种质资源的遗传相似系数及聚类分析
　　根据SSR分子标记统计不同基因型的数据结果，利用NTSYS-pc V2.10软件，计算195份木薯种质间的遗传相似系数，得到相似系数矩阵。结果表明，195份种质遗传相似系数变化范围是0.57～0.99，平均值为0.72。由相似系数获得的次数分布见图2，遗传相似性主要集中在0.65～0.80，占85%；分布于两边的不到10%，说明木薯种质的遗传性状差异较小，多样性较低。
　　采用NTSYS-pc V2.10软件计算遗传相似系数，根据195份木薯种质遗传相似系数矩阵，在相似系数为0.71时，将195份种质划分为7个类群。各个类群的遗传多样性水平在0.419～0.944（表3），说明195份木薯种质资源类型不够丰富，如各类群群内品系之间杂交，后代可进行遗传改良的潜力较小，应选择类群间材料进行杂交组合。
　　根据NTSYS-pc V2.10软件计算的遗传相似系数进行聚类分析，结果见表4。当以遗传相似系数0.71为阈值时，195份材料划分为7个类群：类群A包括国内大部分的育成品种或品系、地方品种；以SC11等来自不同地区的15份材料组成类群B；以巴西种质和部分国内地方品种为代表材料组成类群C；以大部分瑞士材料为代表材料组成类群D；以CM483-2、CM769-2和瑞士J17组成类群E；以大部分来源哥伦比亚和泰国的材料组成类群F；DCU81为类群G（表4）。
　　2.3 种质资源的遗传信息多样性分析
　　进一步比较国内选育品种、地方品种、品系和国外引进品系间的遗传信息多样性，结果（表5）发现，引进品种（系）的Na、Ne、I、GD和PIC值均高于或接近国内品种、地方品种（系），说明国外材料的遗传差异更丰富。
　　3 讨论与结论
　　从SSR分子标记遗传相似系数结果中可发现，GS值绝大部分集中在0.65～0.80，GS大于0.70的种质数量比较密集。这些结果说明，尽管供试木薯种质的遗传基础相对比较狭窄，但仍然具有一定的遗传多样性。目前，国内学者周建国等[4]、彭靖茹等[5]、薛月寒等[8]及国外学者Kabeya等[18]、Costa等[19]都利用分子标记研究木薯种质的遗传多样性，且涉及的木薯种质从东南亚、南美、非洲等地引入，研究结果均显示，现有木薯种质间的遗传变异水平较低。木薯原始种质通过品种引进，但其基因型并未发生很大变化。因此，DNA水平的分子标记对木薯种质资源的多样性评价可为育种工作提供更加可靠的信息。
　　在本研究中，195份材料的平均相似系数为0.72，而且来源于不同国家和地区的种质都不能明显聚类，仅有几个来源地相近的种质表现出较多相似的形态特征。可能是因为木薯在自然条件下，其不断的杂交，基因位点杂合度较高，加上长期以来主要依靠茎杆进行无性繁殖，使得人工选择较少。同时，国际上最具影响力的木薯科研和种质资源库CIAT（International Center for Tropical Agriculture，国际热带农业中心）和IIAT（International Institute of Tropical Agriculture，国际热带农业研究所）一直致力于不同国家和地区间的木薯杂交育种和种质交流，使得同一木薯种质被引种到世界各地，为适应当地的生态环境发生了适应性的分化、变异并随着无性繁殖，在世代交替的群体中累计，最后形成了某些表型差异大，遗传距离却相近的品种。另外，本研究比较国内选育品种、地方品种、品系和国外引进品系间的遗传信息多样性，发现国外材料遗传差异更丰富，对于常规育种，为拓宽遗传变异范围，实现品种的快速突破，亲本选配时应多用国外品系。
　　参考文献
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