艾灸对阿尔茨海默病模型大鼠行为学及海马超微结构的影响

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　　摘要：目的 观察艾灸对阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）大鼠学习记忆能力及海马CA1区神经细胞超微结构的影响，探讨其治疗AD的作用机制。方法 40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、艾灸组及假手术组。模型组及艾灸组大鼠采用双侧海马立体定向注射聚集态β淀粉样蛋白（Aβ）25-35制作AD模型，假手术组大鼠双侧海马区注射等量生理盐水。造模成功后，艾灸组大鼠于“肾俞”“足三里”与“百会”穴位上方2～3 cm处施予温和灸治疗。正常组大鼠不做任何处理。Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力，透射电镜观察大鼠海马CA1区神经细胞超微结构。结果 模型组大鼠5 d逃避潜伏期、后3 d逃避潜伏期均明显延长，跨越原平台位置次数均明显减少；大鼠海马CA1区神经元体积缩小，形态不规则，线粒体肿胀，基质清淡、有空泡，数目减少，可见线粒体嵴呈畸形样改变，内质网扩张，脂褐素沉积增多。经艾灸治疗后，艾灸组大鼠5 d逃避潜伏期和后3 d逃避潜伏期均明显缩短，跨越原平台位置次数均明显增多；大鼠海马CA1区神经细胞水肿明显减轻，内质网扩张明显改善，线粒体肿胀明显减轻。结论 艾灸治疗可促进脑内神经细胞的修复，从而改善Aβ所致大鼠学习记忆障碍。
　　关键词：阿尔茨海默病；β淀粉样蛋白25-35；艾灸；海马；超微结构；大鼠
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.11.016
　　中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）11-0058-04
　　Effects of Moxibustion on Behaviors and Hippocampal Ultrastructure of Alzheimer’s Disease Model Rats WANG Shu-ju， SUN Guo-jie， MA Jun， LI Xi， WAN Bo-peng （Acupuncture Orthopedics Institute of Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan 430061， China）
　　Abstract：Objective To observe the effects of moxibustion on learning and memory ability and nerve cell ultrastructure in CA1 region of hippocampus of rats with Alzheimer’s disease （AD）；To discuss its mechanism of action to AD. Methods A total of 40 male SD mice was randomly divided into normal group， model group， moxibustion group and sham-operation group. Stereotactic injection agglutinated Aβ25-35 into bilateral hippocampus of rats in model group and moxibustion group to prepare AD models. Rats in moxibustion group were treated by moxibustion at the points which were located above 2-3 cm away from “Shenshu”， “Zusanli” and “Baihui”. Rats in normal group received no treatment. The learning and memory ability was detected by Morris water maze test. Morphological changes of rat nerve cell ultra structure in hippocampal CA1 region were observed by transmission electron microscope. Results In model group， the average escape latency of five days and the last three days was significantly lengthened， and the times across the platform position significantly decreased. Transmission electron microscope indicated nerve cell structures were damaged and displayed unclearly；mitochondrion swelled， even mitochondrial crista was abnormal and deformed， endoplasmic reticulum of inter organelle expanded and the deposition of lipofuscin increased. After the treatment by moxibustion， the average escape latency of five days and the last three days was shortened obviously， and the times across the platform position significantly increased. In moxibustion group， the edema of nerve cells significantly decreased； 　　dilation of endoplasmic reticulum and mitochondria swelling significantly improved；golgi bodies， mitochondria and ribosomes obviously increased in comparison with the model group. Conclusion Moxibustion can improve the learning and memory impairment caused by Aβ by promoting repairing of nerve cells in brain.
　　Key words：Alzheimer’s disease；Aβ25-35；moxibustion；hippocampus；ultrastructure；rats
　　阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种以进行性高级认知功能障碍和记忆功能丧失为特征的中枢神经系统退行性疾病[1]。临床主要表现为记忆能力、判断能力、学习能力、思维能力、认知能力及行动能力、生活自理能力普遍下降，给患者生活质量和家庭生活带来困扰。针灸在临床上治疗AD疗效亦得到充分肯定[2-4]。艾灸法以其药物作用和温热刺激，常用来防病保健，延缓衰老。宋代窦材《扁鹊心书》指出：“人于无病时，常灸关元、气海、命门、中脘……虽未得长生，亦可保百余年寿矣。”艾灸法还可起到针刺和药物不能达到的作用[5]。本实验将聚集态β淀粉样蛋白（Aβ）25-35立体定向注入大鼠双侧海马制作AD模型，应用艾条温和灸“肾俞”“足三里”与“百会”进行治疗，观察艾灸对AD大鼠学习记忆能力及海马CA1区神经细胞超微结构的影响，进一步探讨艾灸治疗AD的作用机制。
　　1 实验材料
　　1.1 动物
　　40只15月龄健康雄性SD大鼠，体质量350～450 g，华中科技大学同济医学院实验动物医学部，合格证号SCXK（鄂）2010-0009。所有动物均在通风良好条件下分笼饲养，自由摄食、饮水。实验过程中对动物处理符合动物伦理学标准。
　　1.2 主要试剂与仪器
　　Aβ25-35（美国Sigma公司），10%水合氯醛、1%锇酸、2.5%戊二醛（国药集团化学试剂有限公司）。MT-200 Morris水迷宫视频跟踪分析系统（成都泰盟科技有限公司），5 ?L微量进样器（上海安亭微量进样器厂），TB-718E型生物组织自动包埋机（湖北泰维医疗科技有限公司），LEICA ULTRACUTUCT超薄切片机（德国），FEI Tecnai G212透射电镜（荷兰）。
　　2 实验方法
　　2.1 分组
　　先对大鼠进行Y型水迷宫筛选[6]，淘汰掉反应过于迟钝或特别敏感大鼠，然后将合格大鼠随机分为正常组、模型组、艾灸组及假手术组，每组10只。
　　2.2 造模
　　用无菌生理盐水将Aβ25-35稀释成5 ?g/?L，密封后放于37 ℃培养箱中孵育1周，使其老化成具有毒性的聚集状态，置4 ℃冰箱中保存备用。
　　脑立体定位仪下双侧海马区注射聚集态Aβ25-35制作AD大鼠模型[7]。大鼠10%水合氯醛（40 mg/100 g体质量）腹腔注射麻醉，将其头部固定于脑立体定位仪上，保持前后囟在同一水平上，消毒处理后剪开头皮，定位左右两侧海马区[8-9]（前囟后3.5 mm，中线旁开2.0 mm，硬脑膜下2.7 mm），用台式牙钻机在定位处钻一直径1 mm小孔，将微量进样器垂直插入，每侧缓慢注射1 ?L聚集态Aβ25-35，注射完毕后留针5 min再缓慢拔针，以使Aβ25-35聚集液充分浸润局部组织。出针后立刻缝合头皮，每日给予大鼠10万U青霉素肌肉注射预防感染，连续5 d。假手术组相同部位注射等量生理盐水，正常组未做任何处理，正常饲养。
　　2.3 治疗
　　成模后第2日艾灸组对AD大鼠进行艾条温和灸治疗。参照文献[10]选取穴位，于大鼠的“肾俞”“足三里”与“百会”上方2～3 cm处温和灸。“肾俞”位于第2腰椎下两旁，“足三里”位于膝关节后外侧、腓骨小头下约5 mm处，“百会”位于大鼠顶骨正中。“肾俞”与“足三里”二穴左右隔日交替使用。每日1次，每穴5 min，6 d为1个疗程，疗程间间隔1 d，共治疗3个疗程。其他3组大鼠每日与艾灸组大鼠同时间同方法进行抓取、固定，但不施灸。
　　2.4 Morris水迷宫实验
　　采用Morris水迷宫实验评价大鼠空间学习记忆能力，主要分为定位航行实验及空间探索实验[11-12]。
　　2.4.1 定位航行实验 艾灸治疗结束后第2日开始实验，每日4次，连续5 d。水温控制在25 ℃左右，分别从4个入水点（以W、N、E、S标注）将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠在2 min内寻找到平台的时间，即逃避潜伏期。如果大鼠在2 min未找到平台，实验者将大鼠牵引至平台上停留10 s，再放回笼中，潜伏期计作120 s。大鼠入水点顺序：第1日，W-N-E-S；第2日，N-E-S-W；第3日，E-S-W-N；第4日，S-W-N-E；第5日，W-N-E-S。
　　2.4.2 空间探索实验 第6日撤除平台，从任选的非平台象限入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠2 min内跨越原平台位置的次数。
　　2.5 透射电镜观察
　　行为学检测完成后第2日，每组随机取4只大鼠，10%水合氯醛（40 mg/100 g体质量）腹腔注射麻醉，然后用0.9%氯化钠溶液快速灌注，再用2.5%戊二醛磷酸缓冲液灌注固定，断头快速取脑组织，分离出海马组织。2.5%戊二醛固定，磷酸缓冲液清洗，1%锇酸后固定，丙酮脱水，环氧丙烷浸透，环氧树脂包埋，聚合后超薄切片机切片，透射电镜观察并摄片记录。
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