甲基营养型芽孢杆菌在农业上的应用研究进展

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　　摘 要：甲基营养型芽孢杆菌作为芽孢杆菌属生防菌的新成员，具有抗逆性强、抗菌谱广、环境友好且不易产生耐药性等特点，在倡导绿色生态农业的时代背景下，甲基营养型芽孢杆菌及其制剂将具有非常广阔的发展前景。本文主要从甲基营养型芽孢杆菌的代谢产物、作用机理及在农业上的应用论述其研究进展。
　　关键词：甲基营养型芽孢杆菌;代谢产物;作用机理;应用
　　中图分类号：S-3文献标识码：A
　　DOI：10.19754/j.nyyjs.20190730013
　　 农作物病害防治一直是困扰世界农业生产的难题，一直以来化学农药的大量使用给农作物病害防治带来了极大的便利且取得了显著效果，但随之而来的负面效应如病原菌耐药性的增强、环境污染、大量农产品农药残留超标，也让人越来越难以接受，因此，绿色、无残留、无公害的生物防治方法应运而生。生防菌作为农作物病害防治的有益菌，由于其能够代谢产生多种抗菌物质抑制作物病原菌的生长并竞生为优势菌群，同时还能改善土壤环境，且不会产生耐药性的特点，近年来受到越来越多的关注。
　　 目前，细菌、真菌、放线菌作为生防菌在生物防治中均有应用。其中，芽孢杆菌属作为生防菌中的佼佼者，已有多种芽孢杆菌被研究应用于农作物病害防治，穆常青等[1]发现枯草芽孢杆菌B-332菌株对稻瘟病具有良好的防治效果，纪兆林等[2]研究地衣芽孢杆菌对苹果轮纹病菌和炭疽病菌具有较强的防治效果，陆燕等[3]研究解淀粉芽孢杆菌41B-1对花生白绢病具有良好的防治效果;甲基营养型芽孢杆菌 （Bacillus methylotrophicus） 是Munusamy Madhaiyan等人2010年報道的新种，作为芽孢杆菌属的一员，甲基营养型芽孢杆菌作为生防菌的研究越来越多，其在农作物病害生物防治领域正扮演着越来越重要的角色。本文主要从甲基营养型芽孢杆菌的抑菌代谢产物、作用机理及其在农业上的应用进行综述。
　　 1 抑菌代谢产物
　　 生防菌之所以能起到防治农作物病害的作用，主要归功于其自身生长繁殖所产生的一种或多种抑菌代谢产物，这些抑菌代谢产物起到了类似抗生素的作用，往往具有广谱抗菌性。张龙来[4]等研究解淀粉芽孢杆菌HN011对多种病害的病原真菌具有明显的拮抗作用，如香蕉枯萎病、番茄茎腐根腐病、菜心炭疽病、水稻稻瘟病、水稻纹枯病，经大量理化分析证明其发酵液的代谢产物主要是一些环二肽;孙启利等[5]研究地衣芽孢杆菌W10对油菜菌核病具有较强的防治效果，经分析其抑菌代谢产物为W10抗菌蛋白。
　　 甲基营养型芽孢杆菌代谢产物多样，经研究具有抑菌能力的代谢产物主要有抗菌蛋白、抗菌肽、蛋白酶、纤维素酶、β-1，3-葡聚糖酶、嗜铁素等，目前被报道的一些甲基营养型芽孢杆菌抗菌试验中，这些代谢产物中的几种通常能够被同时检测出来，说明甲基营养型芽孢杆菌可以从不同的途径对相应病原菌进行抑制。采俊香[6]等对抱茎苦荬菜内生甲基营养型芽孢杆菌G-5抗菌蛋白抗真菌特性进行研究，其对番茄早疫病病菌、梨黑斑病病菌和番茄灰霉病病菌均具有较好抑菌效果，抑菌率分别为88.3%、90.5%和95.4%;王洪梅[7]等从土壤中筛选出一株对番茄青枯病病原菌具有较强抑制效果的菌株N5，经鉴定为甲基营养型芽孢杆菌，通过大量理化分析实验，证明其起到抑菌效果的代谢产物为铁载体、β-1，3-葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶及多种脂肽类物质。吕倩[8]等从南海深海海泥中采集的88个细菌样品中分离出一株具有较强抗真菌活性的细菌SHB114，鉴定为甲基营养型芽孢杆菌，其对黄瓜炭疽病菌、立枯丝核菌、黄瓜枯萎病菌等植物病原真菌具有较强的抑制活性。对其抗真菌活性物质跟踪检测，分离纯化得到3个脂肽类化合物，经鉴定均为bacillomycin Lc类脂肽。
　　 2 作用机理
　　 2.1 竞争作用
　　 甲基营养型芽孢杆菌作为芽孢杆菌属生防菌，其主要竞争作用为营养竞争和位点竞争。营养竞争如在产生嗜铁素的甲基营养型芽孢杆菌中，其代谢产生的嗜铁素可与病原菌竞争土壤中的Fe3+，由于铁元素是微生物生长必不可少的微量元素，因而能起到抑制病原菌生长的作用[9];位点竞争是指其通过在植物根际、体表或体内的定殖和繁衍占据有利靶位，来降低病原微生物侵染的机会。
　　 2.2 拮抗作用
　　 拮抗作用主要是甲基营养型芽孢杆菌通过产生各种抑菌代谢产物，来抑制植物病原菌生长或直接将其杀死，目前以抗菌肽、蛋白酶和纤维素酶的拮抗机制研究最为常见。
　　2.2.1 抗菌肽
　　 抗菌肽是一种广泛存在于细菌、真菌、无脊椎动物、脊椎动物、植物乃至人类中的天然小分子抗菌物质[10]，由于其具有广谱抗菌活性且不易产生耐药性的特点，近年来在植物病害生防领域受到越来越多的研究。抗菌肽通常带有一定量的电荷，具有两亲性，按其结构一般可以分为以下几种： α-螺旋、β -片层、环状结构[11]、无规卷曲[11]、复合结构[11]。根据目前的研究，一般认为其抑制或杀死病原菌的作用机理主要有2种，通过自身特殊的分子结构作用于细胞膜，通过破坏胞膜的完整性并形成离子通道，造成细胞内容物外溢、胞外水分大量内流使细胞不能维持正常的渗透压而死亡，这一过程目前发现的有4种作用类型，分别是桶板模型、毯式模型、环孔模型和凝聚模型[12];作用于病原菌胞内靶点，如抑制核苷酸、蛋白质的合成等。
　　2.2.2 蛋白酶、纤维素酶和β-1，3-葡聚糖酶
　　 植物病原真菌细胞壁一般是由几丁质、β-1，3-葡聚糖、纤维素和少量的蛋白质组成，因此部分甲基营养型芽孢杆菌产生的蛋白酶、纤维素酶和β-1，3-葡聚糖酶可以作用于病原真菌细胞壁，造成其细胞壁的溶解而死亡。
　　 2.3  诱导抗性
　　 植物在受到外源物质诱导后，会产生诱导抗性，体内会发生一系列信号传导和物质代谢变化，如自身防御酶水平和活性显著增高，抗病机制得到增强。李桐[13]在甲基营养型芽孢杆菌NJ13对人参锈腐病的生防作用研究中发现，经过NJ13菌株诱导的人参苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶3种防御酶基因，在接种后不同时间点表达量均较无菌水对照组有不同程度的提高。 　　 3 应用
　　 甲基营养型芽孢杆菌自2010年被首次发现并报道以来，国内外研究人员对其生物特性进行了大量的研究和开发，目前，其在农业、工业、养殖业、食品加工、环境保护、医药等方面的应用研究均有报道。作为生防菌芽孢杆菌属的新成员，其在农业生物防治领域已然成为一颗冉冉升起的新星。
　　 由灰葡萄孢菌 （灰霉菌） Botrytis cinerea 引起的灰霉病是世界范围内危害最为严重的真菌性病害，能够侵染包括番茄 Solanum lycopersicum、黄瓜 Cucumis sativus Linn、葡萄 Vitis spp.、草莓 Fragaria ananassa Duch 等蔬菜在内的200多种植物[14]。魏新艳、黄媛媛等[15]从464株海洋细菌中分离出一株具有较强拮抗灰霉菌作用的甲基营养型芽孢杆菌BH21，其具有产生多种抗菌脂肽的能力，发酵液脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌具有较强的拮抗作用，在葡萄灰霉病生物防治中具有潜在应用价值。
　　 我国是世界上几个最大的棉花主产地之一，但每年由大丽轮枝菌 （Verticillium dahliae Kleb.） 引起的黄萎病对棉花生产造成了大量的损失，严重时可减产20%～60%。陈丽华等[16]从棉花植株上分离筛选出一株对大丽轮枝菌具有较强拮抗作用的甲基营养型芽孢杆菌LH-L3，经过室内盆栽实验证明，菌株LH-L3具有较好的促生长和棉花黄萎病防治的效果，具有进一步开发应用潜力。
　　 西瓜枯萎病是由西瓜枯萎尖孢鐮刀菌引起的一种顽固性土传病害，发病率高，造成西瓜秧苗萎蔫坏死，严重影响西瓜产量和质量。殷晓敏[17]等从西瓜枯萎病重病园区中长势良好的西瓜根际分离获得一株甲基营养型芽孢杆菌XG-1，其对西瓜枯萎病菌菌丝生长、孢子萌发具有良好抑制效果;田间小区实验证明，经XG-1菌液灌根处理的瓜苗植株发病率显著降低。
　　 王全[18]等采用对峙法筛选得到一株对白菜黑斑病菌 Alternaria brassicae 具有强烈拮抗作用的甲基营养型芽孢杆菌LBC-2，田间防治试验表明，LBC-2菌剂的病指防效达到79.08%，对白菜黑斑病具有一定的防治作用。
　　 谢学文[19]等从连作多年的黄瓜根际土样中筛选得到一株对黄瓜炭疽病菌 Colletotrichum orbiculare 具有较强拮抗作用的菌株WF-3，2a的田间试验表明菌株WF-3培养物对黄瓜炭疽病具有良好的防治效果，防效分别达到68.14%和73.7%。
　　 胡江春等从辽宁渤海海域的海泥样品中筛选出一株甲基营养型芽孢杆菌BAC-9912，其产生的脂肽类化合物等代谢产物对灰霉菌病原菌 Botrytis cinerea 具有很强的抑菌活性，且安全无公害。多年的田间试验证明BAC-9912对黄瓜、番茄的灰霉、晚疫病，棉花黄枯萎病及苹果树腐烂病均具有显著防效，是一种绿色、新型、高效的生物杀菌剂。2015年12月31日，农业部药检所公示华北制药集团爱诺有限公司甲基营养型芽孢杆菌9912母药和可湿性粉剂在我国首获登记。母药含量为40亿芽孢/g，毒性微毒;制剂含量为30亿芽孢/g，剂型为可湿性粉剂，毒性微毒，喷雾用于防治黄瓜灰霉病，制剂用药量937.5～1，500g/hm2。
　　 4 问题与展望
　　 目前，国内外对于甲基营养型芽孢杆菌在农业上的生防应用研究主要还停留在“室内”开发、试验阶段，考虑到生防菌在大田植物根际、体内或体表的定殖和繁衍是其防控植物病害的基础，因此在选育优良抗病菌株的基础上，要根据菌株自身生长特性，并结合田间环境因素，通过适当的物理、化学、生物等技术手段对其进行改良，增强其田间定殖能力。甲基营养型芽孢杆菌能够产生丰富的代谢产物，但拮抗菌株发挥抗菌作用的具体代谢产物种类及其作用机制还有待进一步研究。
　　 由于传统的化学农业在给人们带来便利和高效的同时也造成了严重的水土污染、农药残留超标、耐药性等问题，因此，具有绿色生态、无公害、不易产生耐药性等多项优点的生物防治产业受到了世界各国研究机构的广泛关注，拥有潜力巨大的市场应用价值。而甲基营养型芽孢杆菌作为近年来新开发的生防菌，具有抗逆性强、代谢产物丰富、抑菌谱广等多种优良特性，在农业植物病害生物防治领域具有广阔的发展前景。
　　 参考文献
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