吉林地区规模化猪场大肠杆菌和沙门氏菌性仔猪腹泻流行情况调查曲歌沙万里

来源:用户上传      作者:高雪

　　摘要 [目的]研究吉林地区规模化猪场大肠杆菌和沙门氏菌性仔猪腹泻的流行情况，分析引起该地区仔猪腹泻的主要致病菌。[方法]试验采集了21家规模化猪场中117份仔猪腹泻粪便样本，进行基因提取、PCR扩增、电泳鉴定和致病性试验。[结果]从117份仔猪腹泻样本中分离出大肠杆菌104份，其中49份具有致病性，占样本总数的42.88%;分离出沙门氏菌19份，其中15份具有致病性，占样本总数的12.82%。[结论]大肠杆菌和沙门氏菌是引起吉林地区规模化猪场仔猪腹泻的主要致病菌，且有混合感染情况。
　　关键词 吉林;规模化猪场;大肠杆菌;沙门氏菌;仔猪腹泻
　　中图分类号 S858.28 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）03-0089-02
　　Abstract [Objective] To study the epidemic situation of piglet diarrhea caused by E. coli and Salmonella sp. in largescale pig farms in Jilin area， and analyze the main pathogens of diarrhea in piglets in this area. [Method] 117 piglet diarrhea stool samples were collected from 21 largescale pig farms to make gene extraction， PCR amplification，electrophoresis identification and pathogenicity test. [Result] 104 of 117 piglet diarrhea samples were isolated， 49 of which were pathogenic， accounting for 42.88% of the total samples;19 of which were Salmonella sp.， 15 of which were pathogenic， accounting for 12.82% of the total samples. [Conclusion] E. coli and Salmonella sp. are the main pathogens of piglet diarrhea in largescale pig farms in Jilin area， and there are mixed infections.
　　Key words Jilin;Largescale pig farm;Escherichia coli;Salmonella sp.;Piglet diarrhea
　　仔豬腹泻已严重影响养猪产业的发展，我国养猪产业相继出现仔猪严重腹泻病情，给养猪业造成了巨大的经济损失[1]。引起仔猪腹泻的病因非常复杂，且病原也很多。另外，在其治疗过程中，由于缺少准确的病原诊断以及对抗生素的滥用等原因，导致病原菌的耐药性逐渐增强，使仔猪腹泻的预防和治疗越来越困难[2]。仔猪腹泻的主要病因之一是细菌的入侵，相关文献报道细菌性仔猪腹泻的主要病原菌有大肠埃希氏菌、沙门氏菌、魏氏梭菌、耶尔森菌等[3]。东北地区不同季节温差变化大，导致吉林地区仔猪腹泻发病率较高，而且病原菌对多种抗生素都产生了很强的耐药性。猪场仔猪腹泻得不到迅速有效的控制，主要是因为生产实践中对病原菌很难进行准确的实验室诊断，从而在临床治疗过程中很难“对症用药”。由于各地区的气候环境、饲养条件、仔猪健康状况等不同，导致各地区细菌性仔猪腹泻的主要病原菌感染情况也不尽相同[4-5]。
　　笔者采用分子检测技术对2017年1月至2017年12月吉林部分地区规模化猪场送检的仔猪腹泻样本进行了检测与鉴定，旨在明确大肠杆菌和沙门氏菌引起吉林地区规模化猪场仔猪腹泻的发病情况，为该地区仔猪腹泻病的防治提供参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 病料来源
　　2017年1—12月，无菌采集吉林地区21家规模化猪场腹泻性疾病病死猪的肠道内容物样本117份。
　　1.2 主要试剂及仪器
　　粪便DNA提取试剂盒购于上海一基实业有限公司;琼脂糖、50×TAE、DNA Marker购于上海铭博生物科技有限公司。
　　PCR扩增仪、凝胶成像系统（美国，ABI公司）、电泳仪（美国，伯乐公司）、生物安全柜（美国，THERMO公司）、立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。
　　1.3 实验动物
　　昆明小鼠750只，体重20～30 g，性别随机，购于吉林大学实验动物中心。
　　1.4 样本采集
　　在无菌手术室内对病死仔猪的腹部进行消毒，切开腹部，采集病变肠道内容物置于无菌的2 mL 离心管内，进行标记后，放于-80 ℃冰箱中保存备用。
　　1.5 基因提取与PCR鉴定
　　1.5.1
　　腹泻样本中细菌DNA提取。参照粪便DNA提取试剂盒说明书中操作步骤提取粪便样本中细菌DNA，-20 ℃下保存备用。
　　1.5.2
　　引物设计与合成。引物由大连TaKaRa公司设计并合成，如表1所示。
　　1.5.4 琼脂糖凝胶电泳。对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电压100 V。
　　1.6 致病性试验
　　1.6.1 大肠杆菌致病性试验。
　　①根据PCR鉴定结果，将鉴定和分离出的104份大肠杆菌菌株接种于LB液体培养基，将接种后的LB液体培养基置于37 ℃摇床中培养24 h，3 000 r/min离心2 min后丢弃上清液，并加入生理盐水进行混匀。此步骤重复3次，菌液的溶剂转换为生理盐水，测定菌液OD值，使其浓度达到1.5×1010 CFU/mL[6-7]。 　　②将624只小鼠随机分成104个大组，每个大组再分成2个小组，每小组3只，分别设为试验组和对照组。
　　③对试验组小鼠腹腔注射0.2 mL的菌液，对照组小鼠腹腔注射0.2 mL的生理盐水。
　　④观察并记录24～72 h内各组小鼠的发病和死亡情况。
　　1.6.2 沙门氏菌致病性试验。
　　①将PCR鉴定和分离出的19份沙门氏菌菌株接种到SF增菌液中增殖培养，分别进行V-P、硫化氢、糖发酵试验。
　　②选取114小鼠随机分成19个大组，每个大组再分成2个小组，每小组3只，分别设为试验组和对照组。
　　2 结果与分析
　　2.1 PCR鉴定结果
　　提取的细菌基因经PCR扩增后进行
　　电泳鉴定，电泳结果如图1所示。从117份腹泻粪便样本中分离鉴定出大肠杆菌104份、沙门氏菌19份。
　　2.2 致病性试验结果
　　由表2可知，104份大肠杆菌中有49份接种小鼠后72 h内导致死亡，挑取肝脏，将病原菌接种到伊红美兰培养基进行培养，有黑色金属光泽的圆滑菌落出现;19份沙门氏菌中有15份接种小鼠后72 h内出现死亡，小鼠肠道内积聚大量淡黄色液体，肠系膜水肿，接种SS琼脂培养基培养，长出无色、中心带有黑褐色、不透明的菌落。结果表明，104份大肠杆菌中具有致病性的有49份，19份沙门氏菌中具有致病性的有15份;117份样本中具有致病性的大肠杆菌占41.88%，具有致病性的沙门氏菌占12.82%。
　　3 讨论
　　仔猪腹泻是生猪养殖中的常发病，多发生于1月龄以内的仔猪，发病数量占总发病猪数量的35%～45%，严重危害猪养殖业的健康发展[8]。原先肠道内无菌群定殖的新生仔猪，随着 觅食、呼吸等生理过程的进行，进入体内的细菌逐渐在肠道内定殖，并且为保持仔猪肠道内菌群平衡、防止有害菌侵入，与肠黏膜的保护屏障形成动态平衡。由于饲养环境的突然改变，仔猪断奶产生的应激、气温的剧变等因素的影响，导致抵抗力下降，打破了肠道内细菌与肠黏膜保护屏障的动态平衡，外来病原菌入侵后引发仔猪腹泻[9]。
　　引起仔猪腹泻发生的诱因很多，如饲喂发霉变质饲料、猪舍通风换气不畅、环境卫生差、免疫力下降等，均会诱发仔猪腹泻[10]。吉林是国家生猪养殖的主要区域之一，因为东北区域四季气候的变化幅度较大，季节温差变化明显，导致仔猪腹泻性疾病发生率高，对生猪养殖危害严重。引发吉林地区仔猪腹泻的主要病原菌对防治该病敏感药物筛选以及防控措施的制定至关重要。该研究结果表明，致病菌大肠杆菌和致病性沙门氏菌是引起吉林地区规模化猪场仔猪腹泻的主要病原菌，分别占仔猪腹泻发病率的41.88%和1282%。
　　参考文献
　　[1] 赵明军，闫若潜，李文山，等.仔猪腹泻病流行形势与防控措施[C]//河南省畜牧兽医学会第八届会员代表大会暨2013年学术研讨会论文集.郑州：河南省畜牧兽医学会，2013：24.
　　[2] 闫学艳.健康与腹泻仔猪肠道菌群差异研究及猪源乳酸杆菌的筛选[D].南昌：江西农业大学，2014.
　　[3] 王伟.贵州省仔猪细菌性腹泻流行病学调查及病原相关基因研究[D].贵阳：贵州大学，2017.
　　[4] PAULO H E，MADSON D M，RAMIREZ A，et al.Effect of age，dose and antibiotic therapy on the development of Clostridium difficile infection in neonatal piglets[J].Anaerobe，2013，22：104-110.
　　[5] JIN S J，DONG J Q，WANG L J，et al.Effects of weaning on immunity and nutrition in Piglets[J].Journal of Northeast Agricultural University，2017，24（3）：84-89.
　　[6] 陈茹.陕西某猪场仔猪腹泻病原菌的分离鉴定[D].杨凌：西北农林科技大学，2015.
　　[7] 杨建英，黄名钱，肖莉春.等.中药复方对大肠杆菌攻毒小鼠的保护作用[J].天然产物研究与开发，2015，27（9）：1607-1611.
　　[8] 缪剑华.生猪腹泻的原因分析與防治方法[J].农业开发与装备，2016（8）：171.
　　[9] 孙宏伟，王泽岩，任少敏，等.猪主要腹泻病的发病机制综述[J].中国动物检疫，2016，33（3）：63-66，70.
　　[10] 杨洪早，王东升，董书伟，等.仔猪腹泻的病因及中药防治研究进展[J].动物医学进展，2016，37（10）：89-93.
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