城市园林废弃物中纤维素高效降解微生物菌系的构建

来源:用户上传      作者:路强强 赵叶子 陈智坤

　　摘要：采用羧甲基纤维素钠（CMC-Na）水解透明圈法、滤纸条崩解法、酶活力比较法、枯茎降解失重法，研究13种常用的纤维素降解菌菌株和5个组合菌系对纤维素的降解效率，结果表明，模式菌种白腐菌（F-6）对CMC-Na具有非常好的降解作用，且产酶活性显著高于其他12种单一菌株（P<0.05）;与未接种菌系（株）相比，组合菌系的滤纸条崩解速率有明显提高;由“链霉菌属A-1+潮湿纤维单胞菌B-3+热带假丝酵母F-5+白腐菌F-6”构建的菌系JX-1产葡聚糖内切酶、外切酶、苷酶活性分别为25.12、14.41、18.54 U/mL，顯著高于其他4个菌系，恒温培养5、10、15 d时的枯茎降解失重率分别较白腐菌显著提高151.94%、73.21%、67.49%，菌系JX-1为园林废弃物堆腐发酵实现纤维素高效降解的最佳微生物组合。
　　 关键词：园林废弃物;纤维素;降解;酶活;白腐菌;微生物菌系
　　 中图分类号：S182   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）06-0272-06
　　 近年来，随着美丽中国理念的深化和生态城市建设规模的扩张，我国城市绿化水平、整体绿量均得到不断提高，同时也产生了大量园林绿化废弃物。城市园林废弃物主要是指在城市绿地、行道树及城郊林地中绿化植物自然或养护过程中产生的草坪、枯枝落叶及林木修剪物等，含有大量的淀粉、纤维素、木质素和营养元素，是一种可再利用的有机资源，也是生态系统物质循环的重要组成部分[1-2]。然而，作为城市固体垃圾的主要来源，每年有近 5 000 万t的园林废弃物进入环卫填埋系统，这不仅造成园林生物质资源浪费和垃圾填埋场收纳能力的下降，也易导致周围水体、大气和土壤环境的二次污染。
　　 目前，关于城市园林废弃物的资源化利用主要是就地粉碎作为绿化土壤覆盖物或简易堆肥作为植物生长基质，但存在粉碎时易产生扬尘、堆腐不透彻时易孳生病菌和臭气等问题[3-4]。经过一定预处理，在适宜条件下利用好氧微生物进行堆肥发酵，以促进大分子有机物降解和腐殖质类物质形成，这是实现园林绿化废弃物资源化、高效化利用的主要途径[5-7]，而构建快速降解、彻底腐熟的微生物菌系是促进大分子物质分解、转化及合成土壤有机质、植物生长营养物质的关键[8-10]。有研究表明，纤维素酶主要包括葡聚糖内切酶、外切酶、苷酶，是催化纤维素快速水解、诱导木质素降解酶（胞外过氧化酶、胞外酚氧化酶）产生的核心酶系，它们协同作用可将纤维素水解、降解为纤维低聚糖及葡萄糖[11-17];而产纤维素酶的微生物菌系组合与剂量差异在很大程度上影响堆肥过程中堆体的升温速率和腐熟彻底性[18-19]。
　　 本研究结合菌间拮抗关系，采用羧甲基纤维素钠水解透明圈法、滤纸条崩解法、酶活力比较法及枯茎降解失重法，对微生物肥料中常用的13种纤维素降解菌进行单一菌株筛选和组合菌系复配，以期获得高效降解园林废弃物中纤维素的复合微生物菌系，为城市园林绿化废弃物的资源化处置与高效化利用提供参考依据与技术支持。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　1.1.1 供试菌株 降解纤维素常用的13种功能菌株（表1）由中国工业微生物菌种保藏管理中心、中国普通微生物菌种保藏管理中心、陕西省科学院土壤资源与生物技术应用重点实验室、陕西省微生物研究所提供，经陕西省微生物研究所孙晓宇副研究员菌间拮抗关系鉴定，表明菌株相互间无拮抗关系、无抑制孢子产生作用。
　　1.1.2 菌株培养及发酵 细菌采用营养肉汤培养基（NA）发酵培养，培养基组分为：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，pH值为 7.0～7.2;发酵条件为：装液量50 mL/250 mL三角瓶，培养温度32 ℃，摇床转速160 r/min，培养时间24 h。
　　 真菌采用马铃薯培养基（PDA）发酵培养，培养基组分为：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然;发酵条件为：装液量为50 mL/250 mL三角瓶，培养温度为28 ℃，摇床转速为160 r/min，培养时间为72 h。
　　 放线菌采用马铃薯改良培养基（PDA+）发酵培养，培养基组分为：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁2 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然;发酵条件为：装液量为50 mL/250 mL三角瓶，培养温度为28 ℃，摇床转速为160 r/min，培养时间为48 h。
　　1.1.3 菌系组合与发酵 在单株初筛的基础上，选择降解纤维素效率较高的菌株组合成5个菌系，每组菌系至少包含细菌、真菌、放线菌各1株（表2），由于白腐菌为降解纤维素的模式菌，设计每组菌系时均含有该菌株[20-22]。根据各菌种差异进行单独培养，再等体积比例混合。发酵条件为：液体装液量为50 mL/250 mL三角瓶，培养温度为30 ℃，摇床转速为160 r/min，培养时间为36～48 h。
　　1.1.4 菌种斜面和平板的制备 制备不同菌种斜面和平板时，在每1 000 mL相应液体培养基中添加琼脂15～20 g，经高温高压湿热灭菌，自然冷却即可，灭菌温度为121 ℃，灭菌时间为20 min。
　　1.2 微生物对纤维素降解效率的测定
　　1.2.1 羧甲基纤维素钠（CMC-Na）水解透明圈法测定 将各菌株直径为1 cm的菌饼分别接种至CMC-Na平板培养基上培养24～72 h，以不添加任何菌株作为空白对照（CK）;0.1%刚果红水溶液浸染30 min，弃染液，用1 mol/L NaCl水溶液脱色1 h;分别测定菌落直径（d）、水解透明圈直径（D），单位为cm;计算CMC-Na水解透明圈的Dp值表示菌株降解纤维素的能力[23]，公式为：
　　Dp = （D/d）2。 　　1.2.2 滤纸条崩解法测定 各菌株采用相对应的液体培养基和发酵条件进行三角瓶培养，以不添加任何菌株作为空白对照（CK）;每瓶中放置1 cm×6 cm 滤纸条3片，重复3次;每隔3 h观察并记录滤纸条崩解情况和时间[24]。
　　1.2.3 酶活力法测定 采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法[25-26]测定葡聚糖内切酶、外切酶、苷酶活力，用1 mL酶底物反应液1 min催化纤维素水解产生还原糖（葡萄糖）的量（μmol）反映微生物对纤维素的降解效率。测定内切酶活力的处理方法为：取适量稀释倍数的粗酶液0.5 mL，加入pH值为5.0的1% CMC-Na柠檬酸缓冲液1.5 mL，50 ℃恒温水浴30 min;加入DNS试剂3 mL，煮沸5 min。测定外切酶活力的处理方法为：取适量稀释倍数的粗酶液0.5 mL，加入pH值为5.0的0.05 mol/L柠檬酸缓冲液1.5 mL、脱脂棉50 mg，50 ℃恒温水浴60 min;加入DNS试剂3 mL，煮沸5 min。测定苷酶活力的处理方法为：取适量稀释倍数的粗酶液0.5 mL，加入柠檬酸缓冲液1.5 mL、脱脂滤纸条50 mg，50 ℃恒温水浴60 min;加入DNS试剂3 mL，煮沸5 min。处理液均采用TECAN Infinite 200 PRO酶标仪测定波长为540 nm处的吸光度值，以不添加任何菌株处理的作为空白对照（CK），并根据葡萄糖标准曲线折算酶活。酶活计算公式为：
　　X=（A×N）/（V×T×M）。
　　式中：X表示纤维素酶活力，U/mL;A表示根据吸光度值在葡萄糖标准曲线获得的还原糖生成量，μg/mL;N表示粗酶液的稀释倍数;V表示加入酶液的体积，即为0.5 mL;T表示酶促反应时间，内切酶为30 min，外切酶和苷酶为60 min;M表示葡萄糖的分子质量，为180。
　　1.2.4 枯茎降解失重率法测定 2017年11月，采集西安植物园水景区自然枯萎芦苇[Phragmites australis （Cav.） Trin. ex Steu]的茎秆、枯叶、花穗，其基本物料有机质、全碳、全氮含量分别为830.06、481.47、4.15 g/kg，碳氮比为116.02，pH值为7.8;风干，并剪碎至1～2 cm细条，经湿热灭菌法灭杀杂菌及虫卵;无菌水浸泡过夜，并冲洗可溶性有机物;105 ℃烘干，待用;称取已处理的枯茎10 g、硫酸铵0.4 g、硫酸镁0.1 g装入250 mL三角瓶，每瓶加入pH值为7.0的5 mmol/L磷酸缓冲液30 mL、混合菌悬液6 mL，以加入6 mL蒸馏水为空白对照（CK）;混匀，50 ℃恒温培养15 d;每菌系处理9组，并分别在恒温培养5、10、15 d时观察枯茎的降解情况，每次取3组，蒸馏水洗涤、过滤其降解物，剩余物105 ℃烘干至恒质量，称量未降解枯茎质量，计算其降解失重率[27]。降解失重率计算公式为：
　　D=（Mp-Ms）/Mp×100%。
　　式中：D表示降解失重率，%;Mp表示降解前枯茎质量，即为10 g;Ms表示未降解物质量，g。
　　1.3 数据统计分析
　　 采用Excel 2010软件对试验数据进行整理与制图，采用DPS 9.50软件进行差异性显著分析，显著性检验采用最小显著性差异检验法（LSD法）（α=0.05）。
　　2 结果与分析
　　2.1 单一菌株对纤维素的降解效率
　　2.1.1 CMC-Na水解透明圈法测定 葡聚糖内切酶对CMC-Na具有很强的水解能力，测定计算CMC-Na水解透明圈的Dp值，可反映不同菌株产内切酶的活力水平，进而可有效反映降解纤维素分子内多聚糖的能力[28]。由表3可见，模式菌种白腐菌（F-6）对CMC-Na具有非常好的降解作用，其水解透明圈Dp值相对最高，达7.23;按照菌种的种属类型，Dp值大小由高到低大致呈：真菌>放线菌>细菌;真菌F-3、F-2、F-5的Dp值相对偏高，分别为6.95、6.41、5.54，放线菌中菌株A-1的Dp值相对较高，为6.22，细菌中菌株B-3、B-4、B-2的Dp值相对较高，依次为5.37、4.43、3.49。
　　2.1.2 滤纸条崩解法测定 纤维素酶是具有纤维素降解能力酶的总称，在相同培养条件下，不同微生物菌株对滤纸条的崩解速率差异可反映其产纤维素酶的生物代謝活力大小，从而进一步可反映降解纤维素的能力。由表3可见，放线菌、细菌类菌株对滤纸条崩解所需时间相当，为30 h左右，而真菌类所需时间相对长，约为36 h;放线菌中，菌种A-1的崩解时间相对最短，为29 h;细菌中，菌株B-3、B-2、B-4导致滤纸条崩解时间相对较短，分别为25、29、29 h;真菌中，菌株F-3、F-1、F-4、F-6崩解滤纸条的时间相对较短，分别为34、35、36、36 h。
　　2.1.3 酶活力法测定 葡聚糖内切酶能在纤维素分子内部任意裂解β-1，4糖苷键，而外切酶主要从纤维素分子的非还原端依次裂解β-1，4糖苷键，释放纤维二糖分子。由表3可见，真菌菌株F-6、F-5、F-3的产内切酶活性分别为21.51、19.78、7.35 U/mL，产外切酶活性分别为14.33、12.38、548 U/mL，显著高于放线菌、细菌和其他真菌（P<0.05），真菌菌株F-6、F-5产苷酶活性分别为16.02、12.60 U/mL，显著高于放线菌、细菌和其他真菌;放线菌中，菌株A-1产内切酶、外切酶、苷酶活力相对较高，对应各酶活性分别为5.04、4.00、6.03 U/mL;细菌中，各菌株产内切酶活力相对较低，酶活性在1.36～1.73 U/mL之间，其中菌株B-3的产内切酶活力相对最高，菌株B-3、B-2、B-1产外切酶和苷酶活力相对较高，酶活性分别为 2.84、2.72、2.19 U/mL和3.29、3.38、3.15 U/mL。 　　2.3 组合菌系对纤维素的降解效率
　　2.3.1 滤纸条崩解法测定 由表4可见，5个组合菌系在25～30 h内可彻底崩解滤纸条，其中，JX-1的滤纸条崩解速率相对最快，崩解时间约为25 h。
　　2.3.2 酶活力法测定 由表4可见，组合菌系的产纤维素酶活力明显高于单一菌株，相互间存在显著性差异（P<0.05）;菌系JX-1、JX-2、JX-3产内切酶活力相对较高，酶活性分别为25.12、22.23、20.52 U/mL，菌系JX-1、JX-2、JX-5产外切酶和苷酶活力相对较高，酶活性分别为14.41、14.07、13.64 U/mL和18.54、17.16、16.17 U/mL。
　　2.3.3 枯茎降解失重率法测定 测定枯茎降解失重率可真实反映微生物菌系对园林废弃物的降解效率，体现菌系所产纤维素酶、木质素酶及其他酶的活力水平。本试验发现，在芦苇枯茎混合液中接种5个组合菌系和单一菌株白腐菌（F-6）恒温培养3 d时，芦苇枯茎表面均不同程度地有白色菌丝散布生长;恒温培养8 d时，菌落基本铺满枯茎表面，并呈棉絮状。由图1可知，恒温培养5 d时，接种菌系 JX-1、JX-2、JX-5、JX-4的枯茎降解较菌系 JX-3、白腐菌显著（P<0.05），失重率D值分别为16.15%、13.69%、12.98%、11.19%;恒温培养10 d时，5个组合菌系枯茎降解失重率达20%左右，其中，失重率最高的为菌系JX-1，其失重率D值达21.11%，显著高于其他处理;与接种F-6（白腐菌）的枯茎降解失重率相比，菌系JX-1恒温培养5、10、15 d时的枯茎降解失重率分别显著提高 151.94%、73.21%、67.49%;恒温培养15 d时，与未接种菌株（CK）相比，接种各菌系的枯茎降解失重率有显著提高，其中，接种JX-1、JX-5、JX-2的失重率D值相对较高，分别为33.37%、29.21%、28.87%。
　　3 结论与讨论
　　 纤维素是吡喃型D-葡萄糖残基以β-1，4-糖苷键连接而成的复杂结晶分子，在适宜的发酵培养条件下可通过外源微生物代谢产酶作用，快速实现纤维素聚合物的裂解[29]。纤维素酶是一类能够任意切断β-1，4-糖苷键的酶总称，是单一微生物自然代謝和复合微生物协同作用的产物，而接种富产纤维素酶的微生物是实现农林废弃物快速降解的有效手段[30]。然而，由于单一微生物存在产酶条件和酶类型的差异，导致动态复合酶系不完善，从而对纤维素的降解速率产生影响。本研究通过单一微生物菌株的筛选和复合微生物菌系的构建，旨在获得园林废弃物堆腐过程中多样、高产纤维素酶的微生物菌群。
　　 有研究表明，通过羧甲基纤维素钠（CMC-Na）水解透明圈的出现时间可推测菌株产酶时间，水解透明圈Dp值大小可直观反映菌株产酶能力和酶浓度;滤纸条崩解速率可反映菌株产酶的协同作用，而单一菌株的崩解时间与菌液在波长为600 nm生长曲线的吸光度峰值存在一致性[31];单一菌株酶活筛选过程中，透明圈Dp值、滤纸条崩解速率与菌株产酶能力、酶活力及酶间协同作用存在一定的正相关性[32]。本研究发现，链霉菌属（Streptomyces sp.）A-1菌株的水解透明圈Dp值为6.22，在试验放线菌中相对最大，滤纸条崩解速率约为29 h，相对最快，其产葡聚糖内切酶、外切酶、苷酶活性分别为 5.04、4.00、6.03 U/mL，也相对最高;潮湿纤维单胞菌B-3菌株的水解透明圈Dp值为5.73，在试验细菌中相对最大，滤纸条崩解时间约为25 h，崩解速率相对最快，其产葡聚糖内切酶、外切酶、苷酶活性分别为1.73、2.84、3.29 U/mL，也相对最高;白腐菌的水解透明圈Dp值为7.23，在试验真菌中相对最大，其滤纸条崩解速率约为36 h，并非最快，但其产葡聚糖内切酶、外切酶、苷酶活性分别为21.51、14.33、16.02 U/mL，显著高于其他单一菌株（P<0.05）。
　　 纤维素降解是多种酶协同作用的结果，单一菌株通常无法产生所有的纤维素酶，而组合菌系可实现酶类型的复合和酶活力的提升，同时可提高降解过程中微生物菌群类型与数量、缩短纤维素降解时间，并促进难降解有机物的转化。本研究结果表明，与单一菌株相比，5种组合菌系的产酶活性有明显提高，与白腐菌相比，菌系JX-1、JX-2的产内切酶活性分别较之提高16.8%、3.3%，产苷酶活性提高15.7%、7.1%，菌系JX-1、JX-2中均含有产酶活性相对较高的菌株A-1、F-5、F-6;含单一菌株相对最多的组合菌系JX-5，其产酶活性并非最高，甚至低于模式菌株白腐菌，这说明菌系产酶活性作用的发挥是多种酶有机协同的结果，而并非单一菌株酶活力的数量加和，而菌系中各菌株培养条件的差异对菌系酶活的影响、酶间的协同作用机理等有待深入研究;相对单一菌株，组合菌系的崩解速率有明显提高，菌系JX-1与潮湿纤维单胞菌菌株B-3的崩解速率一致，崩解时间约为25 h，较热带假丝酵母菌株F-5崩解速率提高34.2%;各菌系对芦苇枯茎的降解效率远高于白腐菌，菌系JX-1的降解效果相对最佳，恒温培养5、10、15 d的枯茎降解失重率D值分别为16.15%、21.11%、33.37%，菌系JX-1、JX-2、JX-3、JX-4接种培养15 d时的枯茎降解失重率D值比白腐病菌株 F-6分别提高67.5%、44.9%、39.3%、46.7%。因此，由“链霉菌属A-1+潮湿纤维单胞菌B-3+热带假丝酵母F-5+白腐菌F-6”构建的菌系JX-1是促降解园林废弃物中纤维素相对较好的微生物组合，可应用于城市园林废弃物的资源化处理。
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