ctDNA检测及靶向药物在非小细胞肺癌中的应用

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　　摘要：非小细胞肺癌（NSCLC）为最常见的肺癌病理类型，约占肺癌总数的 85%。近年来随着对NSCLC生物学及肿瘤发展机制的深入研究，关于NSCLC的早期检测及靶向治疗也取得了明显进步。在早期检测领域，ctDNA检测作为一种非侵入性的NSCLC检测方法受到了广泛的关注，多项研究表明ctDNA有望作为肿瘤细胞检测的可靠生物标志物。在NSCLC治疗领域，多种以酪氨酸激酶抑制剂和免疫治疗为基础的药物逐步推广应用，这些药物显著提高了患者的无进展生存期和总生存率。本文主要从NSCLC的ctDNA检测及靶向治疗展开论述，探讨ctDNA的聚合酶链式反应和测序检测以及靶向治疗和免疫治疗在NSCLC中的应用，旨在为NSCLC诊断及治疗提供参考。
　　关键词：非小细胞肺癌;ctDNA检测;靶向治疗;酪氨酸激酶抑制剂;免疫治疗
　　中图分类号：R734.2                                文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.11.013
　　文章编号：1006-1959（2020）11-0038-04
　　Abstract：Non-small cell lung cancer （NSCLC） is the most common type of lung cancer pathology， accounting for approximately 85% of the total number of lung cancers. In recent years， with the in-depth study of NSCLC biology and tumor development mechanism， the early detection and targeted therapy of NSCLC has also made significant progress. In the early detection field， ctDNA detection has received widespread attention as a non-invasive NSCLC detection method， and many studies have shown that ctDNA is expected to be a reliable biomarker for tumor cell detection. In the field of NSCLC therapy， a variety of drugs based on tyrosine kinase inhibitors and immunotherapy have been gradually promoted and applied. These drugs have significantly improved the progression-free survival and overall survival of patients. This article mainly discusses the detection of ctDNA and targeted therapy of NSCLC， and discusses the application of polymerase chain reaction and sequencing detection of ctDNA and the application of targeted therapy and immunotherapy in NSCLC.
　　Key words：Non-small cell lung cancer;ctDNA detection;Targeted therapy;Tyrosine kinase inhibitor;Immunotherapy
　　肺癌（lung cancer）是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，大部分患者确诊时已处于晚期，手术切除是Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲa期非小细胞肺癌（NSCLC）最有效的疗法，但晚期肺癌患者治疗预后仍不理想[1]。因大多数患者在诊断时存在转移性病灶，因此长期生存期的改善需要更有效的全身治疗。目前，肺癌的主要治疗方法包括手术、化疗、放疗及分子靶向治疗，其中靶向治疗药物具有临床效果显著、不良反应少的优点，被越来越多学者们所认可[2]。ctDNA是一种可重复性的无创“液体活检”诊断技术，对癌症特异性分子改变的检测有重要意义[3]，且在一定程度上避免了肿瘤的异质性[4]。本文主要就NSCLC的非侵入性ctDNA检测及靶向治疗进行综述，以期为NSCLC的诊断及治疗提供参考。
　　1 ctDNA与非小细胞肺癌
　　肿瘤患者检测最直接的临床样本是肿瘤组织，但由于肿瘤异质性的存在，单凭位点穿刺或活检不能反映肿瘤的全貌，而通过手术采集患者肿瘤组织进行檢测存在一定的风险[5]。循环无细胞肿瘤衍生DNA （circulating cell-free tumour-derived DNA，ctDNA）是由肿瘤细胞产生，释放到血液中游离存在的DNA。ctDNA的检测作为一种非侵入性的非小细胞肺癌检测方法，在癌症的诊断及检测方面受到了广泛的关注，多项研究表明ctDNA有望作为肿瘤细胞检测的可靠生物标志物，是一种更为精确、灵敏的检测标记物[6]。ctDNA检测最大的挑战是有效区分人源背景DNA与肿瘤DNA。在样本中，因存在大量人源DNA，因此需要更为灵敏的方法来识别ctDNA[5]。ctDNA检测方法主要分为测序法和聚合酶链式反应衍生方法（polymerase chain reaction，PCR），包括突变扩增阻滞系统（Amplified Refractory Mutation System PCR，ARMS PCR）、数字PCR（digital PCR，dPCR）、新一代测序（Next generation sequencing，NGS）等[6]。 　　1.1 ARMS PCR  ARMS是一种在PCR基础上发展起来的检测已知点突变的方法，也称为等位基因特异扩增法[7]。其主要操作方法是设计两个5'端引物，一个与突变DNA互补，一个与正常DNA互补，仅当靶等位基因存在时，扩增才能正常进行。目前基于ARMS检测ctDNA的试剂盒已经被国家药监局批准使用，实现了对稀有突变的检测，具有较高的敏感性与特异性。Zhang Q等[7]使用ARMS PCR检测非小细胞肺癌中表皮生长因子EGFR基因突变，证实了ARMS PCR是一种快速、灵敏的检测方法。灵敏度、特异性和一致率被认为是肿瘤组织突变检测的金标准，Cabanero M等[8]研究显示，ARMS的灵敏度在50%～75%，特异性在85%～100%，一致性在72.7%～94.3%，远高于常规PCR技术。
　　1.2 dPCR  dPCR是另一种定向检测 ctDNA 的方法，通过将一个PCR反应分成多个较小的反应来量化ctDNA，包括微滴式数字PCR、乳液PCR和chip-PCR[8]。它实现了对变异基因的绝对定量，提高了检测的灵敏度与特应性。Oxnard GR等[9]使用dPCR檢测了接受奥西替尼治疗获得性EGFR耐药患者的T790M基因的突变存在，结果显示其灵敏度为66%～92%，特异性为87%～100%，一致性为70%～93%，灵敏度稍高于ARMS法[10，11]。
　　1.3 NGS  基于寡聚核苷酸DNA的靶向测序作为一种更为经济实惠的方法已经用于靶基因面板甚至是人类外显子组的测序。NGS的出现变革了基因组测序领域的发展，极大的降低了测序成本，使基因组测序技术不再受限于昂贵的价格。NGS依赖于文库的构建，通常ctDNA因为基因片段较短，所以化学法即可满足其文库的制备。Chin RI等[12]开创性的使用NGS对NSCLC患者的ctDNA进行定量，通过生物信息学的方法，比对癌症细胞突变库及癌症基因库，靶向定位139个复发基因突变序列，涉及521个外显子和13个内含子，覆盖的基因长度约为125kb，并能准确的识别缺失、点突变及结构改变。该研究表明，ctDNA分析能更好地检测早期癌症，并可用于区分残留病变和治疗相关变化。外显子全基因组测序不需要先验的肿瘤分子特征，Perdigones N等[13]利用外显子测序监测6例晚期肺癌、乳腺癌及卵巢癌患者的治疗反应，研究发现在原发肿瘤组织和ctDNA中基因突变存在极高的一致性。然而全基因组测序因为成本较高，限制了该方法在肿瘤ctDNA检测中的实用性。
　　由于大多数NSCLC患者确诊时已经处于肺癌晚期，因此通过手术方法进行的组织活检对一些患者往往是不可行的，ctDNA检测作为一种非侵入性的诊断技术，在不能进行组织活检、高并发风险及耐药性效果监测的患者中发挥着越来越重要的作用[14]。在实际应用中，ARMS和ddPCR具有较高的特异性及一致性，但灵敏度较低。NGS作为新兴检测方法，在该领域的优势已经得到显现，但是对于ctDNA拷贝数较低的样本，NGS仍具有较大的挑战，如何精准、高效识别低拷贝的ctDNA将会大幅度提高检测的灵敏度。此外，该方法在一定程度上依赖于生物信息学分析，因此生物信息学分析工具及方法的进步会在一定程度上提高其检测的特异性。
　　2靶向药物治疗
　　近年来，NSCLC的治疗策略逐渐从经验性化疗演变为基于组织学和分子标志物的个性化诊疗方案。目前已在高达60%的肺腺癌和50%～80%的肺鳞癌中发现了致癌驱动基因的突变，其直接导致肿瘤生长、增殖。NSCLC的靶向治疗针主要针对这些突变蛋白激酶或受体产物，以受体单克隆抗体（Monoclonal antibodies，mAb）或酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors，TKI）的形式出现。常见治疗靶点为表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）和间变性淋巴瘤激酶（Anaplastic lymphoma kinase，ALK）。多项研究证明靶向治疗对晚期肺癌患者有明显的临床效益，同时免疫治疗有利于宿主免疫系统识别癌症为外来物，刺激免疫系统，解除允许疾病生长和扩散的抑制[15]。
　　2.1受体酪氨酸激酶  受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinases，RTKs）是一种跨膜糖蛋白，与配体结合后激活众多的细胞内通路，在正常代谢过程中具有重要作用，如细胞增殖和分化。RTK 在许多癌症的发生和发展中也具有关键作用。RTK包括 ALK 受体、表皮生长因子 （Epidermal growth factor，EGF） 和血管内皮生长因子[16]。
　　2.1.1 EGFR TKI类药物  EGFR作为酪氨酸激酶受体ErbB家族的主要成员，是原癌基因c-erbB1的表达产物。EGFR突变常见于肺腺癌中，最常见的突变是外显子19的缺失及外显子21的点突变。针对 EGFR的靶向治疗可使得下游信号通路的传导抑制，实现抑制癌症的效果，目前治疗NSCLC通常使用EGFR TKI类药物[12]。常见的治疗药物有阿法替尼、吉非替尼等，这些药物增了细胞凋亡，抑制细胞生长、血管生成、侵袭和转移[17]。多项研究多项研究已证实 EGFR TKI类药物对晚期EGFR突变的肺癌的治疗疗效，有研究显示，在未经治疗的晚期（ⅢB或Ⅳ期）肺腺癌患者中，吉非替尼的治疗效果优于卡铂-紫杉醇化疗。在EGFR 阳性患者中，吉非替尼组的无进展生存期显著长于化疗组;在EGFR阴性患者中，化疗组的无进展生存期显著延长。耐药性是EGFR TKI治疗的挑战之一，最常见的是通过T790M继发获得性 EGFR 突变。在T790M中，蛋氨酸取代了EGFR酪氨酸激酶结构域790位的苏氨酸，并降低了第一代厄洛替尼、吉非替尼和第二代阿法替尼EGFR TKI 的有效性。第三代 EGFR TKI奥希替尼对T790M1晚期 NSCLC 有效[18]。 　　2.1.2 ALK TKI类药物  ALK编码跨膜受体酪氨酸激酶，在7%的NSCLC患者中，ALK基因与棘皮动物微管相关蛋白样4（Echinoderm microtubule-associated protein like 4，EML4）基因融合，产生EML4-ALK 融合癌基因。EML4-ALK 融合癌基因也称为 ALK 重排，能促进细胞生长和增殖。ALK 重排常见于年轻的腺癌患者，ALK TKI类药物克唑替尼是ALK阳性NSCLC的首选治疗药物，也是全球首个口服EML4-ALK融合基因抑制剂。对克唑替尼耐药或不能耐的患者可使用第二代ALK抑制剂，如色瑞替尼、艾乐替尼、布加替尼。在既往接受过治疗和未接受过治疗的患者中，与细胞毒性治疗相比，克唑替尼可改善中位无进展生存期[19]。大多数既往接受克唑替尼治疗的患者也可从第二代ALK抑制剂中获益，与一线细胞毒治疗相比，色瑞替尼可延长ALK阳性NSCLC中位无进展生存期[20]。
　　2.1.3 ROS1类药物  ROS1编码受体酪氨酸激酶，当重排导致其酪氨酸激酶结构域与伴侣基因。由于 ROS1 和 ALK 激酶結构域之间的高度同源性，用于治疗 ALK 阳性肿瘤的药物包括克唑替尼，色瑞替尼和氯拉替尼在 ROS1阳性肿瘤中也显示出明显的活性。
　　2.2免疫治疗  靶向细胞毒性T淋巴细胞抗原-4 （cytotoxic T-lymphocyte antigen-4，CTLA-4） 的单克隆抗体及免疫阻断剂（immune checkpoint blockers，ICBs）标志着肺癌治疗护理的一个新方向。美国 FDA 批准的首个ICB是易普利姆玛（ipilimumab），是一种阻断 CTLA-4 的人免疫球蛋白G1单克隆抗体，可用于治疗转移性黑色素瘤[21]。在肿瘤发生过程中，PD-1信号转导主要由肿瘤内 PD-L1的适应性表达驱动，使识别肿瘤特异性抗原的 T 细胞失活，允许肿瘤进展和转移。用抗体阻断 PD-1和 PD-L1轴为恢复T细胞介导的抗肿瘤免疫提供了一种方法[22]。多项研究显示，大量NSCLC患者在使用ICB类药物后获益。目前获批或正在开发用于NSCLC的ICB类药物包括抗PD-1人源IgG4纳武单抗（nivolumab）和派姆单抗（pembrolizumab），以及抗 PD-L1人源抗体阿特朱单抗（atezolizumab）等[23]。ICB已被批准作为一线药物治疗晚期 NSCLC 患者，在铂类药物细胞毒治疗期间或之后发生疾病进展的转移性 NSCLC 患者中，与多西他赛治疗相比，纳武单抗治疗的中位生存期显著延长。与多西他赛治疗相比，ICB药物治疗后总生存期得到改善。在一线 NSCLC 治疗中，已将帕博利珠单抗确立为肿瘤 PD-L1 表达水平≥50%的晚期或转移性 NSCLC 患者的新标准治疗。在这些患者中，与含铂细胞毒性治疗相比，帕博利珠单抗可显著改善无进展生存期和总生存期[24]。相比之下，在 PD-L1 表达水平≥5%的患者中，与细胞毒性治疗相比，纳武单抗治疗与无进展生存期或总生存期的改善无关[25]。
　　3总结
　　随着非小细胞肺癌发生发展的机制不断被揭示，其诊断及治疗也发生了巨大的变化。ctDNA检测NSCLC患者EGFR基因，可有效监测靶向药物治疗的临床效果，为肺癌晚期患者的分子诊断提供了“液体活检”的可能。但该方法尚处于起步阶段，ctDNA检测灵敏度、检测的成本和时效问题是该领域亟待解决的问题。此外，对NSCLC肿瘤生物学的深层理解使靶向治疗的发展成为可能，预示着个性化医疗时代的到来。随着口服EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼的引入，NSCLC患者开始接受分子靶向治疗。ICB治疗方法的引入延长了患者的生存期，靶向药物的低毒性、高效性的优势，为晚期NSCLC患者的治疗提供新的思路：晚期NSCLC患者可通过检测驱动基因，选择针对突变基因的靶向药物，最终实现了精准治疗、改善预后。未来，相信随着ctDNA检测及靶向药物治疗的进一步发展，会有越来越多NSCLC患者从ctDNA检测及靶向治疗中获益。
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　　收稿日期：2020-03-11;修回日期：2020-04-18
　　編辑/成森
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