超声提取及HPLC测定蒲公英中绿原酸
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摘 要：采用高效液相色谱（HPLC）法测定蒲公英中的绿原酸含量，通过正交试验优化蒲公英超声提取的工艺条件。结果表明：超声提取优化工艺条件为甲醇浓度60%，提取时间40min，提取温度28℃。在优化条件下，采用HPLC法测定焦作地区4个蒲公英样品，其绿原酸含量在0.268～0.281mg/g。因此，超声提取是一种HPLC分析绿原酸含量的适宜前处理方法。
关键词：蒲公英;绿原酸;提取;检测
中图分类号 TQ461 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2020）15-0036-03
Abstract： To determine of chlorogenic acid in dandelion by HPLC， the ultrasonic extraction conditions were optimal by orthogonal test. The results shown that optimum extraction conditions are as follows： methanol concentration 60%，time 40min，temperature 28℃. Under the optimum extraction conditions. Content of chlorogenic acid for four samples from Jiaozhu city were The content of chlorogenic acid of four dandelion samples from Jiaozhu were determined by HPLC. The content of chlorogenic acid from samples were0.268-0.281mg/g. So ultrasonic extraction was a suitable pre-treatment method for determine chlorogenic acid in dandelion.
Key words： Dandelion; Chlorogenic acid; Ultrasonic extraction; Determine
蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.），為菊科蒲公英属多年生草本植物[1-2]，具有抗菌[3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]等作用。蒲公英的主要活性成分有绿原酸、咖啡酸、黄酮、多糖、甾醇、萜类化合物等[6-7]，其中绿原酸具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂等功能作用[8-9]，是蒲公英中重要的活性成分。为了有效地分析蒲公英中绿原酸，需要对其进行有效提取，目前常用的提取方法为热回流法和溶剂浸提法[10]，但提取时间均较长。为了快速准确分析蒲公英中绿原酸，本研究采用超声强化提取、HPLC法分析蒲公英中绿原酸，为蒲公英的加工利用提供支撑。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器 蒲公英采自河南省焦作市武陟县，实验室烘干，粉碎后备用;绿原酸对照品（纯度≥99%）：成都曼思特生物科技有限公司;甲醇（色谱纯）、乙酸（优级纯）、乙腈（色谱纯）：国药集团;240W PS-40A型数控超声波清洗器，深圳市康洁洗净电器有限公司;安捷伦1100型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司。
1.2 试验方法
1.2.1 色谱条件 采用Agilent ZoRBAX SB-C18色谱柱（250×4.6mm 5μm），流动相以乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92）为流动相，流速1.0mL/min;柱温30℃;波长326nm，进样量10μL。
1.2.2 绿原酸标准曲线的绘制 采用甲醇准确配制成质量浓度分别为0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.80μg/mL、1.60μg/mL的标准溶液，在326nm下HPLC测定峰面积。
1.2.3 超声提取蒲公英中绿原酸的条件选择 称取一定量粉碎的蒲公英，依次选择不同甲醇溶液（20%、40%、60%、80%和100%）、不同提取时间（10、20、30、40、50min）及不同提取温度（20、25、30、35、40℃），在超声提取装置中提取，提取后合并滤液，滤纸过滤后采用微滤膜过滤，定容后采用HPLC法测定绿原酸含量。
1.2.4 正交试验优化 在单因素实验的基础上，以得率为指标，以甲醇浓度（A）、超声时间（B）、超声温度（C）为因素，采用L9（3）4正交试验进行优化。
2 结果与分析
2.1 绿原酸标准曲线的绘制 根据1.2.1的条件，以绿原酸质量浓度（X）为横坐标，相应的峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，其结果见图1。由图1可知，曲线方程为[Y=35.196X+0.2951（R2=0.9994）]。
2.2 甲醇溶液浓度对绿原酸得率的影响 依次选择不同甲醇溶液（20%、40%、60%、80%和100%）、提取时间40min，提取温度（30℃），测定不同甲醇溶液浓度对绿原酸得率的影响，其结果见图2。由图2可知，在甲醇浓度60%以前，随着浓度的增加，绿原酸的提取得率增加，浓度大于60%以后，继续增加浓度，得率反而下降。这是由于60%甲醇的极性大小和绿原酸极性相似，按相似相溶原理，60%甲醇浓度是提取适宜的浓度。
2.3 提取时间对绿原酸得率的影响 采用60%甲醇溶液，提取时间（10、20、30、40、50min），提取温度（30℃），测定不同提取时间对绿原酸得率的影响，其结果见图3。由图3可知，在提取时间40min以前，随着时间的增加，绿原酸提取得率增加，但提取时间40min以后，继续增加时间，得率增加较小，这是由于40min已经将绿原酸充分提取。因此，40min是适宜的提取时间。 2.4 提取温度对绿原酸得率的影响 采用60%甲醇溶液，提取时间40min，测定不同提取温度对绿原酸得率的影响，其结果见图4。由图4可知，30℃以前，随着温度的增加，绿原酸提取得率增加，但30℃以后，继续增加温度，得率减少，这是由于高温对绿原酸有破坏。因此，适宜的提取温度为30℃。
2.5 提取工艺条件的优化 在单因素试验的基础上，选用L9（3）4正交试验表，就甲醇浓度、超声时间、超声温度时对得率的影响进行了正交试验。因素水平表見表1，试验结果见表2。由表2的R值可见，各因素影响的顺序从大到小依次为甲醇浓度>时间>温度。提取工艺的优化条件是A2B2C1，即甲醇浓度60%，超声提取时间40min，超声提取温度28℃，按该条件进行3批放大实验，平均得率达0.278%。
F检验结果表明（表3），甲醇浓度和提取时间对得率在所考察的范围内影响显著，而超声提取温度在所考察的范围内影响不显著。
2.6 蒲公英中绿原酸含量 在最佳提取条件下，采用HPLC对焦作地区采集的4个不同蒲公英样品进行了3次重复测定，其含量结果如表4所示。由表4可知，不同样品绿原酸的含量差异不显著（P>0.05）。
3 结论与讨论
试验结果表明，超声提取蒲公英中绿原酸的适宜条件为：甲醇浓度60%，提取时间40min，提取温度28℃，平均得率达0.278%。样品的前处理方法对试验结果具有重要的影响。目前，在进行蒲公英绿原酸测定时，常采用热回流法和溶剂浸提法，但提取时间长。为减少提取时间，常采用物理场强化提取是较好的方法。超声波提取是利用超声波产生的机械效应、空化效应和热效应，加大介质分子的运动速度、增大介质的穿透力，从而加速提取生物有效成分，且超声波提取温度低、提取率高、提取时间短。因此，用于HPLC分析前的前处理是一适宜的方法。
参考文献
[1]梁引库，张萍，李云祥，等.蒲公英活性物质对阴道加德纳菌的抑制及作用机理研究[J].药物分析杂志，2020，40（03）：462-469.
[2]侯荣荣，杜峰涛，邹星月，等.蒲公英的活性物质及其应用研究进展[J].安徽农学通报，2019，25（22）：27-28
[3]延永，张亦琳，吴永玲，等.响应面法优化蒲公英总黄酮提取工艺及其抑菌活性[J].广西林业科学，2019，48（02）：223-228.
[4]侯荣荣，杜峰涛，邹星月，等.蒲公英的活性物质及其应用研究进展[J].安徽农学通报，2019，25（22）：27-28，53.
[5]李欢，许艳艳，高进勇，等.蒲公英根多糖的体外抗炎作用研究[J].动物医学进展，2019，40（05）：75-78.
[6]饶志威，杜光，姜琼，等.蒲公英根多糖的研究进展[J].海峡药学，2019，31（05）：34-36.
[7]李艳芝，刘树玲，刘文杰，等.蒲公英黄酮类成分超声辅助半仿生提取及含量测定[J].济宁医学院学报，2020，43（01）：5-9.
[8]夏琴，张新选.HPLC法测定蒲公英中绿原酸和咖啡酸的含量[J].西北药学杂志，2019，34（04）：462-465.
[9]李盛建，王慧，吕磊，等.HPLC-DAD法同时测定蒲公英配方颗粒中6种成分的含量[J].中南药学，2019，17（10）：1714-1717.
[10]肖开心，朱滢嘉，陈瑞，等.蒲公英水煎液主成分咖啡酸含量测定的方法学研究[J].贵州科学，2019，37（06）：47-50.
（责编：张宏民）
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