响应面法优化中药复方中总黄酮提取工艺及药理作用研究

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　　摘      要：目的：探索中藥复方中黄酮最佳工艺，研究各因素对其抗氧化能力的影响差异。以中药复方为实验材料进行响应面优化实验，并测定黄酮的抗氧化能力。经响应面实验证实提取复方中黄酮的最佳工艺为回流温度84 ℃、回流时间2 h、料液比1∶30 mg·mL-1，此时黄酮的占比为4.51%。体外药理实验表明：DPPH清除率为85.66%，纤体复方中总还原力为0.89 Abs，为抗坏血酸的0.67倍，该复方具有显著的抗氧化活性。
　　关  键  词：总黄酮含量;响应面优化;中药降血脂
　　中图分类号：TQ 041       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）05-0830-04
　　Abstract： Objective： to explore the optimum technology of flavonoids in TCM and to study the difference of antioxidant activity among different factors. Response Surface Methodology （RSM） was used to optimize the antioxidant activity of flavonoids. Response surface experiments confirmed that the optimal extraction process of flavonoids in the compound was reflux temperature 84 ℃， reflux time 2 h， feed/liquid ratio 1∶30 mg·mL-1， and the proportion of flavonoids was 4.51%. In vitro pharmacological experiments showed that the scavenging rate of DPPH free radical was 85.66%， and the total reducing power of the compound was 0.89 Abs， 0.67 times that of ascorbic acid.
　　Key words：  Total flavonoid content; Response surface optimization; Chinese medicine forlowering blood lipids
　　根据卫生部官方统计，我国高血脂发生率高达25%，并且有日益广泛化的趋势。高血脂症不仅受遗传因素的影响，与后期的生活习惯、饮食健康、起居睡眠等息息相关。高血脂症可紊乱脂质代谢，引发多种慢性疾病，影响生命质量[1]。体内脂质排泄异常，可引起血管硬化，间接诱发供血不足甚至心肌梗塞[2]。
　　近年来，国外常用降脂药多以人工合成为主，副作用显著，临床验证其见效快但易伤脾胃，所以中药降血脂愈来愈受到人们的喜爱[3，4]。高血脂症可导致肝失疏泄、脾胃失调、气虚血弱[5]，决明子、荷叶、薏仁等中药经研究都具有较好的降血脂功效。本实验旨在研究实验室研究自制降脂复方清除自由基能力和抗氧化活性，以期为制备降血脂新药提供实验基础。
　　陈俊其[6]等优选三种不同溶剂提取黄酮，结果表明黄酮在乙醇中溶解最充分，因此本次提取溶剂选用乙醇。黄酮在高温下因结构不稳定而分解，降低溶出率[7]，本实验采用超声波辅助乙醇加热回流的方法，可加快提取进程，增大溶解度。
　　 本次实验以中药复方中黄酮得率为目的，设计响应面实验，研究回流时间、回流温度、料液比对最终实验的影响[8]，测定抗氧化活性。
　　1  试剂与器材
　　DPPH、亚硝酸钠、芦丁对照品[9];离心机、双频恒温数控超声波清洗器、旋转蒸发仪、恒温水浴锅等[10]。
　　2  实验部分
　　2.1  含量测定
　　2.1.1  芦丁标曲
　　按照规定方法绘制标准曲线。回归方程 y=0.502 9x+0.007 5，R2=0.998 3，R2>0.998表明所得方程具有可行性和线性关系。
　　2.1.2 总黄酮含量测定
　　量取30 mL新配制的80%乙醇溶液倒入1.00 g中药粉末，密封超声20 min，加热回流，分离上清液，定容稀释，低温密封保存。移液枪吸取1 mL，测定其吸光度[11]。
　　2.1.3  单因素实验
　　同上述黄酮测定方法，测定吸光度值，生成趋势表，最高点所对应的水平即为该因素的最佳工艺。
　　2.1.4  响应面实验
　　分析3个自变量的改变对响应值作用的规律，在单因素实验的数据分析上，设计响应面优化选取最佳提取组合[12]，见表1。
　　2.2  抗氧化能力测定
　　2.2.1  DPPH自由基清除率
　　配制DPPH储配液，避光冷藏保存。参照下表加样进行实验，结合空白组，计算DPPH清除率[13]。
　　2.2.2  总还原力
　　根据最新版药典标准方法测定总还原力[14]，测定700 nm下稀释溶液的吸光度，同时以不同梯度的Vc作阳性对照，评价中药复方中黄酮的氧化还原能力。
　　3  实验结果
　　3.1  响应面实验
　　以复方黄酮得率为目的，根据回归模型，得到总黄酮得率Y与3个变量间的线性关系：Y=45.06-0.98A+1.62B+4.69C+0.74AB+1.57AC-2.25BC-6.38A2-5.03B2-1.73C2，见表3。 　　分析ANVOA结果，A（料液比）、B（回流温度）作用于实验结果比C（回流时间）明显;F值=9.82，P值<0.05， 表明黄酮得率与各考察结果之间密切相关[15]，实验结果可靠;根据R2=0.876 3， Radj2=0.913 0，即实验结果几乎不受误差影响16]，该回归模型的建立较为可靠。F值可表示各变量与实验结果之间的关系密切程度，依次为C>B>A[17]。
　　3.2  响应面交互作用分析
　　响应面分析图可用于确定最佳工艺参数，曲面弯曲程度与该因素对实验结果的敏感程度相关[18]。由图1可知，保持回流温度80 ℃，黄酮浸出物量会随着回流时间延长而显著变多，在所选范围内，存在最大值[19]。
　　根据图2，响应面相对较倾斜，等高线排列相对不紧密，因此回流温度和料液比对实验结果主要是由其共同作用引起，与回归模型分析结果一致，最高点即为固定回流时间不变只考虑温度和料液比影响时总黄酮得率的最大值[20];料液比曲面比回流温度曲面更为倾斜，更占优势[21]。
　　根据图3，响应面起伏坡度较大，等高线弯曲程度较大，推断回流时间和料液比对黄酮测定作用较大，交互作用较小，与方差分析吻合;固定回流温度，随着提取溶剂的增多，更有利于黄酮的溶解，达到饱和后黄酮类物质不再浸出，时间延长致使黄酮分解，蛋白和多糖类物质从细胞中流出，导致提取的溶液中杂质过多[22]。
　　3.3  抗氧化实验
　　3.3.1  自由基清除率
　　溶有DPPH的乙醇溶液极易挥发，需低温冷藏，保存时间不宜过长。该法测定需要考虑诸多因素，不适用于精细测定。
　　如图4所示，当药液浓度较小时，提取液和抗坏血酸对体内自由基的影响较小;药液浓度较大时，自由基大部分被清除，增势缓慢，当药液浓度为达到测定最大值时，黄酮提取液85.66%的自由基遭到破坏，抗坏血酸为90.33%，抗坏血酸对体内自由基的破坏性强于复方总黄酮提取液[23]。
　　3.3.2  总还原力测定（见图5）
　　当质量浓度为0.50 mg·mL-1时，该复方中黄酮总还原力为0.89 Abs，抗坏血酸为1.33 Abs，总还原力可反映抗氧化水平，因此该纤体复方的抗氧化性弱于抗坏血酸。
　　4  结 论
　　含有黄酮类成分较多的物质为天然的还原
　　剂[24]，许多药物的有效成分均为黄酮类物质。因此本实验对中药复方中的黄酮进行优化采用的方法为乙醇回流法，黄酮类物质极性较大，醇类溶剂有利于黄酮的溶解。
　　最佳工艺为回流时间2 h、回流温度84 ℃、料液比1∶30 mg·mL-1，此时中药复方中总黄酮含量为4.51%[25]。当药液浓度为0.50 mg·mL-1，复方中总还原力约0.89 Abs，黄酮提取液85.66 %的自由基遭到破坏，还原力为抗坏血酸的0.67倍，具有显著的抗氧化能力，为降脂复方在食物、保健品和抗氧化剂等方面开发利用扩大市场。
　　参考文献：
　　[1]卢锟刚.决明子、丹参、苦丁茶、股绞蓝不同组分配伍降血脂作用研究[D].武汉：湖北中医药大学，2013.
　　[2]崔英，眭建. 维持性血液透析患者并发心脑血管疾病的危险因素研究[J].中国中西医结合肾病杂志，2016，17（11）：1006-1007.
　　[3]孙胜亮.柚皮活性成分提取分离及在降血脂方面研究[D].重庆：西南大学，2011.
　　[4]乐智勇.泽泻汤降血脂作用机理研究[D].武汉：湖北中医药大学，2012.
　　[5]胡书云，韩冰，王金玲.中药汤剂在治疗高血脂症中的应用效果评估[J].四川中医，2019，37（6）：219-221.
　　[6]陈俊其，秦华珍，尹优，等.山姜属中药黄酮类成分提取及分离富集方法研究进展[J].中医学报，2019，34（11）：2303-2307.
　　[7]滕晶.基于系统辨证脉学构建气变特色脉诊诊断体系[J].山东中医杂志，2018，37（3）：181-183.
　　[8]陈健初. 水芹黄酮类成分分离鉴定和生物活性研究[D].杭州：浙江大学，2014.
　　[9]宋怡伟，赵志刚，韩成云，等.响应面法超声辅助提取香椿叶总黄酮及抑菌效果研究[J].食品研究与开发，2019，40（23）：153-158.
　　[10]陶然，刘金虎，毛会秀，等.基于半仿生酶解技术的中药乌贼墨最佳用酶初步筛选[J].当代化工，2019，48（4）：738-741.
　　[11]曹广超，王舒玉，王彦多，等.正交试验法优选发酵蜣螂粉中总黄酮的提取工艺[J].华西藥学杂志，2018，33（3）：305-308.
　　[12]张鹏，张蝶，唐森，等.羊蹄甲果荚总黄酮提取工艺优化及抗氧化性研究[J].当代化工，2019，48（12）：2717-2722+2726.
　　[13]吴仪君，刘小芳，李万忠，等.白花蛇舌草不同极性部位抗血管生成及抗氧化活性研究[J].中医药导报，2018，24（17）：50-54.
　　[14]单康. 河蚬多肽抗氧化活性及对急性化学性肝损伤的保护作用[D].扬州：扬州大学，2016.
　　[15]黄平，毛坤军，金贤武，等.响应面法优化山蜡梅叶颗粒总黄酮提取工艺[J].中国现代中药，2019，21（12）：1688-1692.
　　[16]邱相坡，梁璇，王文斌，等. 基于响应面法的连翘果实总黄酮闪式提取工艺优化[J].山西农业科学，2020，48（03）：452-457.
　　[17]易永，饶志为，胡锋平，等. 响应面法优化Na2S2O8/H2O2处理垃圾渗滤液生化尾水[J].工业水处理，2018，38（08）：33-37.
　　[18]王立娜，王颖，邢佰颖，等.响应面法优化土鳖虫水溶性蛋白质的提取条件[J].食品与药品，2017，19（1）：26-29.
　　[19]贾洪信.香菜黄酮的提取优化及抗氧化活性的初步研究[J].中国调味品，2018，43（04）：79-84.
　　[20]郝可欣，胡文忠，张清洁，等.响应面法优化超声辅助提取代代花总黄酮的工艺及其抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2019，40（24）：159-164+171.
　　[21]刘淑霞，郭永霞，魏国江，等. 响应面法优化火麻籽蛋白质的提取工艺[J].中国麻业科学，2017，39（01）：37-43.
　　[22]秦国正，琚勇，张明芮，等.响应面法优化黑根霉胞外多糖脱蛋白工艺研究[J].天然产物研究与开发，2017，29（10）：1773-1778+1784.
　　[23]吉惠杰，程振玉，薛俊礼，等.仙人草总黄酮提取工艺优化及抗氧化活性研究[J].中国食品添加剂，2016，（12）：133-138.
　　[24]杨楠，贾晓斌，张振海，等.黄酮类化合物抗肿瘤活性及机制研究进展[J].中国中药杂志，2015，40（3）：373-381.
　　[25]孙艳，杨志伟.火龙果总黄酮提取工艺优化[J].南方农业学报，2016，47（06）：1001-1008.
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