HPLC测定花椒粉中罗丹明B含量的不确定度评定

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　　摘要 根据《食品中罗丹明B的测定》（BJS 201905）方法规定的前处理方式，采用外标法，HPLC进样，对花椒粉中罗丹明B的含量进行不确定度评定。参照JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》，建立测量模型，对整个测量过程中不确定度的来源进行了分析。结果表明，不确定度主要来源于样品称量、体积的量取、重复性和回收率、标准曲线及标准曲线拟合过程等因素。
　　关键词 花椒粉;罗丹明B;不确定度;HPLC
　　中图分类号 TS 202.3 文献标识码 A
　　文章編号 0517-6611（2020）16-0195-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.055
　　Uncertainty Evaluation on Determination of Rhodamine B in Pepper Powder by HPLC
　　NIE Lei1，WANG Yong-xin1，YIN Jun-feng2 （1.Anhui Food and Drug Inspection Institute， Hefei， Anhui 230051;2.Agro-Products Processing Research Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei，Anhui 230031）
　　Abstract According to the pretreatment method specified in the Determination of rhodamine B in Foods （BJS 201905） method， the external standard method and HPLC sampling were used to assess the uncertainty of Rhodamine B content in pepper powder.Refer to JJF 1059.1-2012 Measurement Uncertainty Evaluation and Representation to establish a measurement model and analyze the sources of uncertainty in the entire measurement process.The results showed that the major influential factors of uncertainty were caused by sample weighing， volume measurement， repeatability and recovery rate， standard curve and standard curve fitting process.
　　Key words Pepper powder;Rhodamine B;Uncertainty;HPLC
　　作者简介 聂磊（1970—），男，安徽长丰人，高级工程师，硕士，从事食品安全检验技术与研究工作。
　　收稿日期 2020-07-01
　　
　　花椒粉是一种由花椒制成的调味料，在人们的日常烹调中经常会使用，特别是红花椒加工而成的花椒粉，因其独特的色泽和香味，更加受到青睐。有报道不法分子为追求利润，使用罗丹明B对花椒染色，以次充好[1]。罗丹明 B（rhodamine B，RB）又称玫瑰红 B[2] ，是一种人工合成碱性荧光染料，易溶于水、乙醇，微溶于丙酮、氯仿。有研究表明，摄取、吸入以及皮肤接触罗丹明 B均会造成急性或慢性的中毒伤害[3-4] ，它会引起不同程度的头痛、头晕、恶心等中毒症状[5-6] ，有一定致癌性[7]。因此对于花椒粉中罗丹明B的检测意义重大。然而，在化学分析过程中由于误差的存在，测量结果与实际值往往存在一定的偏离，因此需要对测量结果的不确定度评定进行评定，使测量结果更加准确可靠。笔者采用《食品中罗丹明B的测定》（BJS 201905）[8]方法，测定花椒粉中罗丹明B的含量，从多个角度分析测量不确定度产生的原因，对测定结果进行评定和表述。
　　1 材料与方法
　　1.1 试材 花椒粉，市售商品。 罗丹明B，固体，纯度98.6%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司产品。甲醇、乙腈，色谱纯，天地公司产品;其他试剂均为分析纯;水为 GB/T 6682 规定的一级水。固相萃取柱，Waters公司产品;ZORBAX SB-C18柱，Agilent公司产品。
　　1.2 主要仪器
　　高效液相色谱仪，岛津LC20-AD（配备荧光检测器）;AT100电子天平，梅特勒（0.1  mg）;涡旋振荡仪，IKA MS 3digital;移液器，美国GILSON。
　　1.3 标准品储备液及标准系列配制
　　准确称取罗丹明B标准物质10.0 mg，用甲醇溶解、定容至100 mL容量瓶中（A级）， 配制100 μg/mL罗丹明B标准储备液。用移液管准确移取1 mL标准储备溶液，再用甲醇定容于100 mL A级容量瓶中，配制1 μg/mL罗丹明B标准中间溶液。最后使用20、100、1 000 μL移液器分别移取10、50、100、500、1 000 μL标准中间溶液于10 mL A级容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，得到质量浓度分别为1、5、10、50、100 μg/L的罗丹明B标准系列工作溶液。
　　1.4 样品制备
　　按照BJS 201905的分析方法进行：准确称取2 g花椒粉样品，加入约10.0  mL含0.1%甲酸的甲醇水溶液，于旋涡混匀器上涡旋混匀15 min，于9 000 r/min离心10 min，取提取液层溶液过0.22 μm有机相滤膜后待净化。准确移取5.0 mL提取液至固相萃取柱净化，收集洗脱液，氮吹干，用1 mL流动相溶解残渣，过滤膜，供仪器分析，外标法定量。 　　1.5 数学模型的建立 按照BJS 201905的测定方法计算结果，待测物的含量按式（1）计算：
　　式（1）中，C为从标准工作曲线中读出的试样溶液中待测物的质量浓度（μg/L）;V为试样溶液最终定容体积（mL）;m为称样量（g）;X为试样中待测物的含量（mg/kg）。
　　由测量模型可看出，影响测定结果不确定度urel（X）的主要因素有待测物浓度产生的不确定度urel（C）、称量样品过程中产生的不确定度urel（m）、样品定容体积产生的不确定度urel（V）、試验重复性产生的不确定度urel（）、待测物回收率产生的不确定度urel（R）。由此得到试样中被测物的残留量的相对标准不确定度urel（X）可由（2）式计算：
　　2 结果与分析
　　2.1 试样称量过程中产生的不确定度urel（m）
　　使用去皮称量，称取约2.00 g花椒粉样品，查看天平的检定证书，最大允许误差为±0.01 g，按照矩形分布，其不确定度u（m）=最大允许误差/3=0.005 8 g;urel（m）=u（m）/m=0.000 11。
　　2.2 体积量取产生的不确定度urel（V）
　　量取体积产生的不确定度主要原因为最后定容体积引起的不确定度。试样净化液经氮吹浓缩后，用1.0  mL分度吸量管吸取1.0  mL的流动相溶解残渣。A级1.0  mL分度吸量管最大允许误差为±0.008  mL，按矩形分布考虑，则样品定容引入的相对标准不确定度为
　　urel（V）=0.004 62。
　　2.3 待测物产生的不确定度
　　待测物产生的不确定度主要来源于2个因素，分别是标准系列溶液配制过程中产生的不确定度和由标准曲线拟合时所产生的不确定度。其中标准系列溶液配制包括储备液配制、稀释和标准曲线溶液配制3个部分[9-10]。
　　2.3.1 储备液配制过程引入的不确定度urel（C1）。
　　（1）由标准证书可知，罗丹明B标准品纯度为98.6%，最大允许误差为 ±0.5%，
　　按均匀分布，k=3，其引入的相对标准不确定度为urel（p）=最大允许误差/k×98.6%=0.009 3。
　　（2）根据称量所使用天平检定证书，可知其最大允许误差为±0.2 mg，按均匀分布，k=3，校准物质称量为10.0 mg，则校准物质称量引入的不确定度为u（m标）=最大允许误差/k=0.115 47，则天平称量过程中引入的相对标准不确定度为urel（m标）=u（m标）/5.0=0.023 09。
　　（3）标准储备液是将固体标准物质使用甲醇溶解，并定容至100 mL棕色容量瓶。容量瓶产生的相对不确定度，根据JJG 196—2006《常用玻璃量器 检定规程》的要求，100 mL单标容量瓶（A级），允许最大误差为±0.10 mL，按照均匀分布，k=3，则容量瓶产生的相对不确定度为urel（V标）=最大允许误差/k×100=0.000 58;甲醇的膨胀系数为1.1×10-3/℃，允许温差±5 ℃，温度产生的相对不确定度为urel（T标）=允许温差×膨胀系数/k=0.003 18。
　　因此，储备液配制过程产生的不确定度为urel（C1）=[u2rel（p）+ u2rel（m标）+ u2rel（V标）+ u2rel（T标）]1/2=0.009 8。
　　2.3.2 储备液稀释过程引入的不确定度urel（C2）。
　　分别用1 mL 移液管准确移取1 mL罗丹明B（100 μg/mL）标准储备溶液于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，配制质量浓度为1 μg/mL的罗丹明B中间储备溶液[11]。按照矩形分布来处理，参考GB/T 12806—2011和JJG 196—2006的要求，按A类评定，玻璃器皿及温度波动产生的不确定度见表1;则储备液稀释过程中产生的不确定度按urel（C2）=
　　urel（V1）2+u（V100）2计算。
　　2.3.3 标准系列溶液配制过程产生的不确定度urel（C3）。
　　使用20、100、1 000 μL移液器分别移取10、50、100、500、1 000 μL  1 μg/mL罗丹明B中间储备溶液于10 mL容量瓶中，用流动相溶液定容至刻度，得到质量浓度分别为1、5、10、50、100 μg/L 的罗丹明B标准系列工作溶液。移液器的刻度误差参考JJG 646—2006标准要求，按照A类进行评定，如表2所示。因移液量较小可忽略环境温度变化对体积刻度的影响，仅考虑体积校准引入的不确定度。10 mL容量瓶使用了6次，水的膨胀系数β水=1.8×10-3，温度引起的不确定度为0.003 16。则标准系列溶液配制过程中产生的不确定度为urel（C3）=[urel（V0.01）2+urel（V0.05）2+urel（V0.1）2+urel（V0.5）2+urel（V1.0）2+urel（V10）2×6]12 =0.005 2。
　　2.3.4 标准曲线拟合产生的不确定度urel（C4）。将甲醇溶液配制的5种不同质量浓度的罗丹明B标准系列工作溶液，各取10 μL进样，以标准溶液浓度（Ci）为横坐标、峰面积（Ai）为纵坐标绘制标准曲线，拟合而成的线性回归方程（采用最小二乘法）为Ai=aCi+b，测定数据及计算结果如表3所示。取花椒粉阳性样品，按BJS 201905方法对样品中罗丹明B含量（C0）进行重复测定6次，其结果见表4，则由标准曲线拟合产生的不确定度按式（3）计算：
　　式中，SR为标准溶液待测物峰面积产生的标准差;Ai为罗丹明B标准系列工作溶液中各点的待测物的峰面积;
　　p为对样品罗丹明B含量（C0）的测定次数（p=6）;n为标准曲线的测 　　定点数（n=5）;
　　a为斜率;b为截距;Ci为罗丹明B标准系列
　　工作溶液各点的质量浓度;C0为样品溶液中罗丹明B的质量浓度;
　　为罗丹明B标准系列工作溶液的平均质量浓度，=5i=1Ci/5。
　　相关数据见表3和表4，经计算，=213.2 μg/L，（C0-）=26 721.1，则SR=2 282，5i=1（Ci-）2=169 114.8，u（C4）=0.772 8 μg/L，则标准曲线拟合产生的相对不确定度urel（C4）=u（C4）/C0=0.015 5。
　　2.4 重復性产生的不确定度urel（）
　　对阳性样品1花椒粉样品平行测定6次，见表4。稀释倍数为f=1，重复测定的含
　　量平均值=0.024 mg/kg，标准偏差S（）=0.000 53，不确定度u（）=S（）/6=0.000 22，则由重复性引起的相对不确定度urel（）=u（）/=0.089。
　　2.5 回收率产生的不确定度urel（R）
　　在空白花椒粉样品中添加浓度水平为0.005 0 mg/kg罗丹明B标准物质的样品2，平行测定6 次，稀释倍数为f=1。测量回收率结果列于表5，则平均回收率=92.0%，标准偏差S（R）=0.000 51，不确定度u（R）=S（R）/6=0.000 21，相对不确定度urel（R）=u（R）/=0.000 23。
　　2.6 合成不确定度 若不考虑各不确定度的相关性，则罗丹明B的合成不确定度urel（X）=[urel（C）2+urel（）2+urel（R）2+urel（m）2+urel（V）2]12
　　计算，其中，urel（m）=0.000 11，urel（V）=0.004 62，urel（C1）=0.009 8，urel（C2）=0.006 0，urel（C3）=0.005 2，urel（C4）=0.015 5，urel（）=0.089，urel（R）=0.000 23，则urel（X）=0.008 4。
　　2.7 扩展不确定度
　　在95%置信区间，包含因子k=2，扩展不确定度U=urel（X）×2×=0.000 4 mg/kg，由此得到样品1中罗丹明B含量为（0.024 0±0.000 4） mg/kg。
　　3 小结与讨论
　　该研究按照《食品中罗丹明B的测定》（BJS 201905）方法，对HPLC法测定花椒粉中罗丹明B结果进行不确定度评定，参照JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[12]，建立测量模型，分析了试验过程中不确定度的来源和影响因素。评定结果显示，不确定度主要由样品称量、体积的量取、重复性和回收率、标准曲线及标准曲线拟合过程等因素引入，其原因包括量具的选择和使用、实验室环境温度的控制及试验次数等。因此，在花椒粉中罗丹明B的检测工作中，应重点从以下方面降低其不确定度，减少随机误差：①使用经检定校准的天平和量具，并正确使用检定校准因子;②保持实验室环境条件的相对稳定;③确定合理的测定次数;④规范标准溶液配制的操作，减少样品称量、体积的量取、稀释过程中产生的误差。
　　该研究通过对花椒粉中罗丹明B检验的测量不确定度评定，有助于在依据《食品中罗丹明B的测定》（BJS 201905）开展的检验中，降低由误差带来的风险，提高检验的准确性，也为实验室实施检验过程质量控制提供了必要的参考。
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