基于线粒体CO Ⅰ基因序列的2种仿对虾遗传差异

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　　摘要：哈氏仿对虾和细巧仿对虾是东海经济虾类资源中主要的仿对虾属种类，为调查研究浙江省舟山市近海这2种虾类种质资源现状及亲缘关系，通过PCR扩增获得2种仿对虾线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基Ⅰ，基因长度为 632 bp 的序列片段，共检测到101个变异位点，其中简约信息位点99个，哈氏仿对虾有4种单倍型，细巧仿对虾有3种单倍型。统计碱基组成发现，二者在目的片段上的A+T含量分别为62.0%、62.9%，均显著高于C+G含量。细巧仿对虾的单倍型多样性与核苷酸多样性均高于哈氏仿对虾，采用邻接法构建分子系统树，并基于木村双参数遗传距离计算2种仿对虾的分化时间约在5.93百万年前。初步摸清了哈氏仿对虾和细巧仿对虾遗传多样性现状并比较了两者间的遗传差异，研究结果以期为仿对虾属经济物种的遗传信息和系统发育提供分子生物学参考依据。
　　关键词：哈氏仿对虾;细巧仿对虾;线粒体CO Ⅰ基因;遗传差异
　　中图分类号：S917
　　文献标志码：A
　　文章编号：1002-1302（2020）16-0082-05
　　仿对虾属（Parapenaeopsis）隶属于节肢动物门（Arthropoda）、甲壳动物亚门（Crustacea）、软甲纲（Malacostraca）、十足目（Decapoda）、枝鳃亚目（Dendrobranchiata）、对虾科（Penaeidae），是广泛分布于我国东海海域的一种广温性、广盐性中小型对虾类[1]。国内关于仿对虾的研究大部分集中在形态学[2-3]、资源调查[4-6]以及人工繁育技术[7-8]等方面，且研究对象多针对属或种的分类阶，而对于亲缘关系较近的种间比较研究则相对较少。哈氏仿对虾（P. hardwickii）和细巧仿对虾（P. tenella）作为东海经济虾类资源中占有重要地位的仿对虾属种类，对二者遗传多样性的比较研究尚未见相关报道。
　　线粒体DNA具有母系遗传、进化速度快、结构简单等特点[9]，位于其上的CO Ⅰ、CO Ⅱ、Cyt b、16S rRNA等基因被广泛应用于甲壳动物群体遗传学和系统发育关系分析[10-13]。其中，线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome oxidase subunit Ⅰ，CO Ⅰ）基因作为DNA条形码，成为近年来普遍接受和青睐的物种分类鉴定的分子标记之一[14]。本研究基于线粒体CO Ⅰ基因序列，分析比较东海海域常见的2种仿对虾——哈氏仿对虾和细巧仿对虾遗传多样性现状，并结合GenBank中下载的近缘种序列比对分析，探讨两者的亲缘关系，以期从分子生物学角度为仿对虾属物种种质资源背景提供基础数据资料。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料采集和DNA提取
　　本研究用到的哈氏仿对虾（HF，13尾）和细巧仿对虾（XF，6尾）均于2018年10月采自浙江省舟山嵊泗列岛近海，参考《东海经济虾蟹类》[15]和《虾蟹生物学》[16]等书籍，利用传统形态学方法分类鉴定后，剪取适量肌肉组织，采用传统的酚-三氯甲烷法[17]提取基因组DNA，溶解于100 μL灭菌水中，置于-20 ℃冰箱保存备用。
　　1.2 PCR扩增
　　本研究用于扩增2种仿对虾CO Ⅰ基因序列的通用引物[18]由上海桑尼生物科技有限公司合成，具体序列见表1。PCR扩增的反应体系为25.00 μL，包括0.25 μL浓度为5 U/μL的Taq酶，正反向引物（10 μmol/L）各1.00 μL，10×buffer缓冲液（含Mg2+）2.50 μL，dNTPs（2.5 mmmol/L）2.00 μL，模板DNA（50 ng）1.00 μL，灭菌双蒸水17.25 μL。PCR扩增的程序：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性 45 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环;最后72 ℃延伸5 min。
　　取PCR扩增产物3 μL与等量的6×DNA Loading buffer混合均匀，经1.5%琼脂糖凝胶于水平电泳槽中，电泳分离15 min左右，取出凝胶用在紫外光呈像系统中观察并拍照保存，选取条带明亮、特异性强的扩增产物送上海美吉生物医药科技有限公司进行双向测序。
　　1.3 数据处理
　　使用DNASTAR软件[19]对测序结果进行排序、拼接，经人工检验后截取同源片段;使用DnaSP 5.10软件[20]进行序列分析，统计序列碱基及氨基酸组成、比较密码子不同位点的使用频率，计算保守位点（conserved sites）、变异位点（variable sites）及简约信息位点（parsimony-informative sites），获取DNA多态位点信息以及多样性参数;采用MEGA 5.05（molecular evolutionary genetics analysis）软件[21]进行聚类分析，以邻接法（neighbor-joining，NJ）构建分子系统进化树并重复抽样分析（bootstrap analysis，重复数=1 000）;用其中的Kimura 2-parameter model模型计算个体间遗传距离和种间平均遗传距离。
　　2 结果与分析
　　2.1 CO Ⅰ基因序列分析
　　利用DNASTAR软件进行排序，得到2种仿对虾类CO Ⅰ部分基因632 bp长度的同源片段（图1）。共检测到101个多态位点，无碱基的插入与缺失，其中单一变异位点2个、简约信息位点99个。哈氏仿对虾检测到4个单倍型，包含4个多态位点，均为单变異位点;细巧仿对虾检测到3个单倍型，包含2个多态位点，其中单变异位点和简约信息位点各1个。哈氏仿对虾和细巧仿对虾CO Ⅰ基因序列碱基组成信息见图2。哈氏仿对虾CO Ⅰ基因片段的T、C、A、G的含量分别为35.4%、19.9%、26.6%和18.1%，A+T的含量为62.0%;细巧仿对虾 CO Ⅰ 基因片段的T、C、A和G的含量分别为34.8%、19.3%、28.1%和17.8%，A+T的含量为62.9%。2种仿对虾A+T的含量均明显高于C+G的含量，符合多数甲壳类动物线粒体CO Ⅰ基因序列的研究结果[2，10，13，18]。密码子第3位点T和A碱基含量明显高于C和G，其中A碱基比例最高，分别为39.5%（哈氏仿对虾）和44.0%（细巧仿对虾）。 　　2.2 遗传多样性分析
　　使用DnaSP软件计算2种仿对虾遗传多样性参数。由表2可知，2种仿对虾共检测到7种单倍型，平均单倍型多样度（Hd）为0.713 5，平均核苷酸多样度（π）为0.072 07，平均核苷酸差异数（k）为45.474。尽管细巧仿对虾数量低于哈氏仿对虾，但遗传多样性指标均明显高于后者。
　　使用MEGA软件将CO Ⅰ基因序列翻译成对应的氨基酸序列，获得编码肽链长度为210的氨基酸序列。由图3可知，2种仿对虾间尽管存在4处氨基酸变异位点，但由于同义替换不改变编码氨基酸，因此哈氏仿对虾3种单倍型仅编码1种氨基酸多肽链。细巧仿对虾4种单倍型共编码了2种氨基酸多肽链，其中XF-hap2、XF-hap3和XF-hap4编码的氨基酸种类一致。
　　2.3 遗传距离和聚类分析
　　對2种仿对虾分别计算种内个体间与种间遗传距离，结果（表3）显示，2种仿对虾种间的遗传距离为0.178，个体间遗传距离分别为0.000～0.005（哈氏仿对虾）和 0.000～0.003（细巧仿对虾）。 其中，哈氏仿对虾的最大遗传距离出现在3号和13号个体间，细巧仿对虾的最大遗传距离出现在3号和4号、3号和5号之间。为进一步比较2种仿对虾间的遗传差异并探究其亲缘关系，以凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）为外群（GenBank登录号：HQ127455），采用邻接法构建分子系统发生树。由图4可知，2种仿对虾同种不同个体间以较高的置信值分别聚类，二者相聚之后再与外群聚类。
　　3 结论与讨论
　　受到转录、翻译及碱基突变压力等因素的影响， 不同基因在遗传密码子的使用上通常呈现出一定的偏好性[22]。2种仿对虾CO Ⅰ基因片段的碱基组成呈现出明显的高A+T含量特征，这与虾蟹类线粒体DNA CO Ⅰ序列中普遍存在的现象一致[23]，且密码子3个位点碱基组成基本也符合这一规律。从A+T含量具体大小来看，密码子第3位点>第2位点>第1位点，且密码子第3位点A+T含量明显高于第1、第2位点。进一步比较二者在CO Ⅰ基因片段编码的肽链氨基酸序列组成发现，除亮氨酸和丝氨酸组成比例有细微差异外，其余各氨基酸组成大致相同，推测这与密码子兼并性有关，发生在密码子第3位点碱基的同义突变没有改变其编码的氨基酸[24]。此外，2种仿对虾同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性，氨基酸序列较高的同源性也表明二者较近的亲缘关系[25]。
　　遗传多样性又称为遗传变异，是生物多样性的基础，其水平高低揭示了物种进化的潜力及抵御不良环境能力的强弱[26]。本研究对2种仿对虾遗传多样性参数进行统计发现，尽管细巧仿对虾样本数和单倍型数较少，但其遗传多样性均高于哈氏仿对虾。毛智超等比较了哈氏仿对虾线粒体CO Ⅰ与16S rRNA基因片段的遗传多样性，发现前者变异程度更高，通过计算得出的CO Ⅰ基因片段核苷酸多样性（0.000 87）略低于本研究结论（0.000 98）[18]，推测可能与本研究分析的片段长度较短和样本数偏少有关。合理的取样数量是开展群体遗传学研究的前提和基础[27]，由于样本数量和采样海域的限制，获得的信息量有限，在后续的研究中还将进一步扩大采样规模和数量，以更加全面准确地反映该物种的遗传多样性现状[28]。
　　早在20世纪60年代，Zuckerkandl等就提出生物在进化水平存在“分子时钟”这一假说[29]，结合现代基因库和古化石证据能够大致估算出不同生物门类的起源和进化时间[30]。本研究参考Baldwin等基于CO Ⅰ基因估算对虾科3%/百万年的核苷酸分歧速率，根据种间遗传距离推算出细巧仿对虾分化时间较哈氏仿对虾早5.93百万年[31]，与同类研究中5.55百万年的结果相当[18]。研究表明，仿对虾属分化时间为中新世末期至20新世早期，更新世冰期-间冰期的气候周期性波动引起海平面高度的改变，导致物种栖息地范围经历了不同程度的收缩和扩张，推测西北太平洋边缘海之间的隔离是造成包括仿对虾在内的多种海洋生物发生遗传分化的主要原因。
　　本研究随机采集了浙江省舟山海域嵊泗列岛附近分布的哈氏仿对虾和细巧仿对虾，由于二者亲缘关系较近，仅凭形态学特征难以准确区分，在采样过程中容易出现混淆。而基于线粒体CO Ⅰ基因序列构建的系统发育树可清晰地将哈氏仿对虾和细巧仿对虾分为2支，使之得到有效区分，显示出分子测序技术在区分形态相似种中的优越性，能够较好地验证基于形态学鉴定的物种或分类[32-33]，同时也为今后深入开展该海区虾蟹类种质资源、亲缘关系和遗传多样性研究提供基础资料。
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