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基于网络药理学探讨雷公藤-鸡血藤药对治疗类风湿关节炎的机制

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   【摘 要】目的:探讨雷公藤-鸡血藤药对治疗类风湿关节炎的作用机制。方法:使用中药系统药理学分析平台(TCMSP)筛选雷公藤-鸡血藤的活性成分,使用高通量基因表达数据库(GEO)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、Genecards数据库筛选与类风湿关节炎相关的靶点,通过Cytoscape软件绘制“化合物-靶点”网络图。利用String数据库构建蛋白质相互作用(PPI)网络,利用R语言对靶点基因进行基因本体(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)生物通路富集分析。结果:筛选出木犀草素、山柰酚、雷公藤甲素、甘草查尔酮A等70种活性成分,信号转导与转录活化因子3、丝裂原活化蛋白激酶1、丝裂原活化蛋白激酶14等120个核心靶点,共同靶点主要涉及核受体的活动、乙型肝炎、前列腺癌、肿瘤坏死因子信号通路等1566个生物过程和152条信号通路。结论:对雷公藤-鸡血藤药对治疗类风湿关节炎的作用机制进行了初步探讨,为进一步阐述其作用机制奠定了基础。
   【关键词】 关节炎,类风湿;网络药理学;雷公藤;鸡血藤;药对
   【ABSTRACT】Objective:To explore the mechanism of the drug pair-Tripterygium Wilfordii and Caulis Spatholobi in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods:TCMSP was used to screen the active components of Tripterygium Wilfordii and spatholobus Spatholobi.Databases GEO,OMIM and Genecards were used to screen the targets related to rheumatoid arthritis.The "compound target" network diagram was drawn by the software Cytoscape.The PPI network was constructed using the database String.The target genes were enriched in GO and KEGG by R language.Results:Seventy active components such as Luteolin,Kaempferol,Triptolide and Licochalcone A,and one hundred and twenty core targets,including signal transducer and activator of transcription 3,mitogen activated protein kinase 1 and mitogen activated protein kinase 14 were screened.The common targets mainly involved 1566 biological processes,such as nuclear receptor activity,hepatitis B,prostate cancer,tumor necrosis factor signaling pathway and 152 signal pathways.Conclusion:The mechanism of Tripterygium Wilfordii and Caulis Spatholobi in the treatment of rheumatoid arthritis was primarily discussed,which laid a foundation for further elaboration for its mechanism.
   【Keywords】 arthritis,rheumatoid;networkpharmacology;Tripterygium Wilfordii;Caulis Spatholobi;drug pair
   類风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性炎症性疾病,特点是滑膜组织增生,一般会引起骨和软骨的破坏,最终导致关节畸形和残疾[1]。RA的病理改变是滑膜炎、血管翳形成并逐渐出现关节软骨和骨的破坏[2]。现代研究表明,中医药治疗RA能有效减少患者痛苦,提高预后生存质量,改善西药治疗的依赖性,减少对身体的伤害,具有明显的优势[3]。
   雷公藤味苦、辛,性寒,有大毒,具有祛风湿、通经络、消肿止痛等功效。研究发现,雷公藤在器官移植排斥反应、自身免疫性疾病、肾病综合征、癌症等方面疗效显著[4]。一般认为,其作用机制主要与抗炎和免疫抑制等相关,现代药理研究表明,雷公藤多苷片能够降低RA动物模型外周血及关节局部的促炎细胞因子表达水平[5]。鸡血藤具有活血补血、调经止痛、舒筋活络等功效。现代药理学表明,鸡血藤具有改善造血功能、免疫调节、抗炎等作用[6]。本研究基于网络药理学,通过数据挖掘与分析,预测雷公藤-鸡血藤治疗RA的潜在作用靶点和信号通路,以期为RA的治疗提供新的方向。
  1 方法与材料
  1.1 雷公藤-鸡血藤有效成分及靶点的筛选 在中药系统药理学分析平台(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php),以口服生物利用度(OB)> 30%,药物类药性(DL)> 0.18为筛选条件[7],获得雷公藤-鸡血藤有效成分及作用靶点,并通过人类蛋白质数据库(Uniprot Database,https://www.uniprot.org/)对各靶点人类基因简称进行查询。   1.2 RA作用靶点的筛选 在美国国家生物技术信息中心(NCBI,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据平台,选择“GEO DateSets”,以“Rheumatoid Arthritis”为关键词检索相关数据信息,种属选择人,获取GSE93776原始文件和GPL570-55999的基因注释文件,该数据包含83例RA患者和90例健康者信息。使用R语言(https://www.r-project.org/)对原始数据进行分析,采用多阵列平均分析(RMA)算法进行背景校正和矩阵数据归一化处理,利用Limma程序包分析芯片数据的差异基因,将显著差异基因的筛选条件设定为P < 0.05,差异倍数(FC) > 2[8];运用Plot程序包绘制数据的热图。最终获得RA的差异基因。
   以“Rheumatoid Arthritis”为关键词,通过Genecards(https://genealacart.genecards.org/)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM,https://www.omim.org/)获得RA相关基因,将获取的基因与获取的差异基因取并集,获取RA作用靶点。
  1.3 “成分-靶點”网络构建 利用Strawberry Perl软件(https://www.perl.org/get.html)获取雷公藤-鸡血藤治疗RA的潜在靶点。由Cytoscape软件(https://cytoscape.org/)绘制“活性成分-靶点”网络图,其中用“节点(Node)”表示活性成分或靶点,用“边(Edge)”表示活性成分与靶点的相互作用关系[9]。
  1.4 蛋白质相互作用(PPI)网络构建 将1.3中获取的靶点上传至PPI(String,https://string-db.org/)数据库,筛选条件为种属选择人,最小互作分数值为0.7,其他参数保持默认,获得PPI网络。将得到的结果输入R语言,构建PPI网络核心靶标条图。
  1.5 GO和KEGG分析 利用R语言对1.3中获取的关键靶点进行GO和KEGG分析,GO富集分析包括生物过程(biologica process)、分子功能(molecular function)和细胞成分(cellular component)3个模块,设置阈值校正P < 0.05。由Cytoscape 对KEGG通路富集分析前20名的通路,构建“通路-靶点”网络。
  2 结 果
  2.1 雷公藤-鸡血藤有效成分及相关靶点预测结果 在TCMSP中,符合筛选条件的有效成分70个(雷公藤51个、鸡血藤22个,重复3个),对应潜在靶点2227个(雷公藤1085个、鸡血藤1142个,重复2032个)。在数据库中找到对应基因名的靶点173个。
  2.2 RA的作用靶点 借助R语言分析,共筛选得到115个差异基因,其中上调基因数为49个,下调基因数为66个,并绘制热图,见图1。通过GEO、OMIM、Genecards数据库删除重复值后得到4239个疾病相关靶点。
  2.3 “活性成分-靶点”网络 利用perl软件得到雷公藤-鸡血藤治疗RA的潜在基因120个,对应活性成分45个。利用Cytoscape软件构建“活性成分-靶点”网络,见图2。该网络图包括165个节点和461条边。度值较高的活性成分为木犀草素、山柰酚、雷公藤甲素、甘草查尔酮A、川陈皮素、芒柄花黄素、植物甾醇等,具体见表1。与10个以上化合物存在关系的靶点有CHRM3、CHRM2、NOS2、PPARG、ESR1、PGR、AR、ADRB2、PTGS1、HSP90AA1、PTGS2。
  2.4 PPI网络构建与分析 雷公藤-鸡血藤治疗RA的PPI网络见图3,将所得文件输入R语言,筛选前20个核心靶标绘制条图,结果见图4,邻接点数目 > 20的基因有STAT3、MAPK1、MAPK14、AKT1、JUN、RELA、MAPK8,邻接节点数目越多,成为核心基因的概率越大。
  2.5 富集分析 GO富集分析得到1566个条目,包括分子功能相关条目135个、生物过程相关条目1380个、细胞成分相关条目51个,根据校正过的P值排序,分子功能主要涉及核受体的活动、转录因子活性、类固醇激素受体活性、泛素样蛋白连接酶结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合等;生物过程富集主要涉及对脂多糖反应、对细菌来源分子的反应、对金属离子的响应、对抗生素反应、对类固醇激素反应等;细胞成分主要涉及膜筏、膜微结构域、膜区域、转录因子复杂、囊腔等。
   KEGG富集分析得到144个条目,根据校正过的P值筛选出前20条绘制表格,如表2所示,主要涉及乙型肝炎、前列腺癌、肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素-17(IL-17)信号通路、Th17细胞分化、Toll样受体信号通路等。将前20条KEGG通路及其相关的73个靶点导入Cytoscape软件,得到“通路-靶点”调控网络,见图5,共有93个节点(20个KEGG通路和73个基因节点)和428条边,涉及12条通路以上的基因为JUN、NFKBIA、MAPK8、IKBKB、RELA、AKT1。
  3 讨 论
   雷公藤对免疫性疾病有确切的疗效,但有毒副作用,配以鸡血藤可以降低毒性,增强治疗作用[10]。
  为了减少雷公藤对RA患者生殖系统所造成的影响,高立珍等[11]采用雷公藤6~10 g,配用鸡血藤30 g以改善月经量少或者闭经的症状,鸡血藤具有调经作用(雷公藤能使白细胞减少,而鸡血藤恰能升高白细胞)。雷公藤苦寒清热力强,消肿止痛效著,尤宜于关节晨僵、肿胀难消、红肿热痛、活动受限,甚至关节畸形,为治风湿顽痹之要药。鸡血藤苦甘而温,行血养血、舒经活络。丁锷[12]常用雷公藤配鸡血藤,以养血祛风通络、活血蠲痹止痛,临证收效良好。    本研究筛选得到雷公藤-鸡血藤70个有效成分,45个成分具有潜在治疗RA的作用;作用靶点较多的5个活性成分为木犀草素(47个)、山柰酚(37个)、雷公藤甲素(32个)、甘草查尔酮A(23个)、川陈皮素(22个);木犀草素具有抑制免疫、抗炎的作用[13]。山柰酚是一种黄酮类化合物,既往研究表明,其具有抗癌、抗炎、抗氧化等多种药理学作用;且有研究证实,山柰酚能有效缓解胶原诱导性关节炎小鼠关节炎症状,抑制滑膜炎症、关节软骨及骨质破坏[14]。有实验证实,雷公藤甲素能够明显改善Ⅱ型胶原诱导关节炎大鼠关节肿胀情况,作用机制与促进IL-10、转化生长因子-β表达,增加Treg细胞比例,抑制IL-17、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子、γ干扰素表达有关,并且短期内无明显肝毒性[15]。有实验证实,川陈皮素可以抑制小鼠巨噬细胞中IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白及mRNA的表达,从而发挥其抗炎作用[16]。
   雷公藤-鸡血藤治疗RA的核心基因有STAT3、MAPK14、AKT1、JUN、RELA、HSP90AA1、MAPK8、CDKN1A等。研究表明,STAT3为信号转导子和转录激活子,在RA滑膜成纤维样细胞增殖及炎癥反应中均有影响[17]。相关研究发现,在RA滑膜组织中,炎性因子等因素刺激使MAPK14异常活化,抑制TNF受体超家族成员6诱导的细胞凋亡,使组织中的炎症持续存在[18]。通过敲减AKT的表达,可能对RA出现的滑膜组织异常增殖、侵袭关节组织等病理特征起到一定的抑制作用[19]。目前研究已经证实,RA不仅显示出病理症状的昼夜节律性,而且核受体及其调控的代谢通路紊乱也参与RA的病理过程。
   雷公藤-鸡血藤治疗RA的潜在基因的KEGG通路众多,主要涉及乙型肝炎、前列腺癌、TNF信号通路、人类巨细胞病毒感染、IL-17信号通路等。许多研究表明,感染可能是RA发病机制之一[20]。
  有研究表明,乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白可以通过诱导基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的转录、翻译和分泌来促进细胞迁移。在这种情况下,慢性乙型肝炎状态可能通过上调MMP-3而部分影响RA患者的影像学和临床结局[21]。此外,一项基于1999年至2009年的数据研究显示,与非RA队列相比,RA患者中HBV感染的患病率和风险更高[22]。临床试验发现,采用甲氨蝶呤治疗RA引起的免疫功能障碍导致严重的免疫抑制,最终致使前列腺癌的快速进展和广泛的骨转移[23]。TNF作为一种关键的细胞因子,可以诱导广泛的细胞内信号通路,包括细胞凋亡、炎症和免疫。其在RA患者的关节滑液和滑膜组织中的表达明显上升,并且可影响滑膜中各种细胞,例如巨噬细胞、滑膜细胞、软骨细胞和破骨细胞,进而导致关节微环境的改变,进一步加重关节破坏[24]。有研究显示,IL-17可明显促进RA患者成纤维样滑膜细胞增殖,且IL-17刺激的滑膜成纤维样细胞分泌中性粒细胞激活肽-78、IL-8、生长相关癌基因、单核细胞趋化蛋白-1明显增加[25]。
   综上所述,本研究通过网络药理学对雷公藤-鸡血藤治疗RA的机制进行初步分析,为深入研究提供新思路。但是仅通过潜在的基因靶点、信号通路研究存在一定的局限性,有待进一步验证。
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  收稿日期:2020-04-16;修回日期:2020-05-28
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