HPLC多成分测定及主成分分析法对不同产地鲜地黄质量评价

来源:用户上传      作者:李询　董诚明　齐大明　李曼　邢冰　侯杨威

　　摘要：以采自河北、山西、河南等省的35份鲜地黄为试验材料，以浸出物、多糖、梓醇、毛蕊花糖苷、地黄苷A、地黄苷D、益母草苷为考察指标，采用HPLC多成分同时测定与主成分分析法，评价不同产地鲜地黄品质差异。结果表明，3个产地的35批鲜地黄品质差异明显，河南省的样品地黄苷A、毛蕊花糖苷含量较高，河北省的样品地黄苷D含量较高，山西省的样品多糖含量较高，35份鲜地黄样品的综合主成分值范围为-0.647 9～2.974 1，河南产区的主成分分析均值最高，为0.306 8，其次是河北省，为-0.183 7，再次是山西，为-0.281 2。不同产区地黄品质存在差异，综合分析以河南产区为佳，HPLC多成分同时测定与主成分分析相结合可以综合评价鲜地黄的质量，为地黄原药材的质量评价提供便捷有效的参考依据。
　　  关键词：鲜地黄;HPLC;浸出物;多糖;环烯醚萜苷;苯乙醇苷;主成分分析
　　  中图分类号： S567.23+9.01;R284.1  文献标志码： A
　　 文章编号：1002-1302（2020）19-0225-05
　　收稿日期：2019-12-19
　　基金项目：河南省重大科技专项（编号：171100310500）;国家标准化项目（编号：ZYBZH-Y-HEN-18）;国家重点研发专项（编号：14104584-2018-1）。
　　作者简介：李 询（1994—），女，河南郑州人，硕士研究生，从事生药学研究。E-mail：1025552320@qq.com。
　　通信作者：董诚明，教授，从事中药材规划范种植技术研究。E-mail：dcm371@hactcm.edu.cn。
　　 地黄（Rehmannia glutinosa Libosch.）为玄参科多年生草本植物，主产于河南省、河北省、山西省、东北等地，以古怀庆府一带的怀庆地黄栽培历史最长，被称为怀地黄，气候、土壤等因素造成各地地黄有效成分有所差异。地黄作为临床常用药，质量控制至关重要，地黄中含有环烯醚萜苷类及苯乙醇苷类等主要成分，具有利尿、降糖、滋阴补血[1-3]，调节免疫，抗炎、抗衰老等作用[4-7]。2015年版《中国药典》中以梓醇和毛蕊花糖苷的含量作为质量评价的主要指标，难以全面考察其质量。
　　近年来地黄在山西、河南、河北等省种植较多，为研究各产地鲜地黄的质量差异，本研究选取河南、山西、河北3地的鲜地黄（北京3号）为研究对象，以浸出物、多糖及地黄中5种苷类物质的含量为考察指标，用高效液相色谱法同时测定梓醇、地黄苷A、地黄苷D、益母草苷及毛蕊花糖苷含量。建立便捷、可靠的方法同时测定鲜地黄中多种成分含量，分析各产地地黄质量差异，可为建立鲜地黄质量标准评价体系提供科学依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 样品与试剂
　　试验样品由笔者在不同产地采集，经河南中医药大学董诚明教授鉴定，为玄参科植物地黄北京3号的块根，55 ℃低温烘干打粉后供本试验研究使用。样品信息见表1。
　　1.2 浸出物、多糖含量检测
　　浸出物按照《中国药典》2015年版冷浸法测定;多糖含量按照苯酚-硫酸法测定[8]。
　　1.3 梓醇、地黄苷A、地黄苷D、益母草苷及毛蕊花糖苷含量测定
　　1.3.1 色谱条件
　　色譜柱为安捷伦ZORbAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5-Micron），流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0 min，1.3%A;5 min，1.5%A;6 min，3%A;14 min，3%;15 min，4%A;20 min，4%A;25 min，20%A;40 min，20%A）;体积流量为1 mL/min;柱温35 ℃;检测波长0～20 min：203 nm，21～35 min：334 nm;进样量20 μL（图1）。
　　1.3.2 对照品溶液的制备 精确称取梓醇、地黄苷A、地黄苷D、益母草苷及毛蕊花糖苷对照品，加超纯水配置成浓度分别为2.4、0.3、0.2、0.2、0.3 mg/mL 的混标溶液。
　　1.3.3 供试品溶液的制备 精确称取生地黄样品粉末0.8 g，置于具塞平底烧瓶中，加入甲醇50 mL，称定质量，超声提取1 h，放至室温，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，精确量取续滤液20 mL，浓缩近干，残渣用水溶解，转移至10 mL量瓶中，临用前用0.22 μm微孔滤膜过滤。
　　1.4 方法学考察
　　1.4.1 线性关系考察 取“1.3.2”节中制备的对照品溶液，记为溶液1，依次稀释1.25、2.00、4.00、10.00、20.00、40.00倍，记为混标溶液2～7（溶液7仅用于毛蕊花糖苷的线性范围考察）。按照“1.3.1”节的方法进样，以对照品进样量为横坐标（x），峰面积积分值为纵坐标（y），绘制标准曲线，得到回归方程见表2。
　　1.4.2 精密度试验 精确吸取同一鲜地黄供试品溶液，按照“1.3.1”节的色谱条件测定，重复进样6次，记录峰面积，计算得梓醇、地黄苷A、地黄苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷的相对标准偏差（RSD）分别为0.62%、1.75%、1.46%、1.74%、0.20%，表明仪器精密度良好。
　　1.4.3 重复性试验 精确称取同一批次的鲜地黄粉末6份，按“1.3.3”节方法制备供试品溶液，按照“1.3.1”节方法进行色谱条件测定，记录色谱图。得梓醇、地黄苷A、地黄苷D、益母草苷及毛蕊花糖苷的RSD分别为1.88%、1.27%、1.49%、0.68%、1.73%，表明此方法重复性良好。
　　1.4.4 稳定性试验 精确吸取同一鲜地黄供试品溶液20 μL，分别于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 h，按照“1.3.1”节的色谱条件测定。结果梓醇、地黄苷A、地黄苷D、益母草苷及毛蕊花糖苷峰面积的RSD分别为1.47%、0.31%、1.31%、1.61%、0.88%，表明室温条件下供试品溶液在24 h 内基本稳定。 　　1.4.5 加样回收率 精确称取已测定含量的25号样品粉末6份，每份0.2 g，分别精确加入梓醇、地黄苷D、地黄苷A、益母草苷及毛蕊花糖苷对照品6.51、0.12、0.37、0.72、0.32 mg，按照“1.3.3”节的方法制备供试品溶液（所有试剂均减半），按照“1.3.1”节的色谱条件测定，结果显示平均加样回收率分别为99.87%、101.78%、96.14%、97.69%、102.57%，RSD值分别为0.96%、1.23%、1.35%、0.58%、1.03%，表明此方法能够很好地提取出指标性成分。
　　1.4.6 样品测定
　　35份鲜地黄样品按“1.3.3”节进行制备，以“1.3.1”节条件测定，每个样品重复3次。
　　2 结果与分析
　　按照“1.2”“1.3”节所述检测35份样品中考察指标的含量，结果见表3。浸出物含量最高的是N21，多糖含量最高的是X13，梓醇含量最高的是N22，毛蕊花糖苷含量最高的是N22，地黄苷D含量最高的是B5，地黄苷A含量最高的是N22，益母草苷含量最高的是N33。
　　 运用主成分分析法，浸出物、梓醇、地黄苷D、地黄苷A、益母草苷、毛蕊花糖苷、多糖含量为指标性成分，对35份地黄样品中的百分含量进行综合分析。根据降维结果，共挑选出3个主成分PC1、PC2、PC3，特征值分别为2.674、1.372、0.887。累计贡献值为70.476%，具有代表性，可以用来评价地黄质量。综合主成分值可以反映不同地黄的质量，得分越高表示成分质量分数越高，地黄质量越好。由表4可知，35份鲜地黄样品的綜合成分值在-0.647 9～2.974 1，表明不同产地鲜地黄的成分量范围。综合值排序可以看出N22号即河南省温县赵堡镇赵堡村的鲜地黄质量最好，X13号即山西省永济市韩阳镇韩阳村的鲜地黄质量最差，河南省、河北省、陕西省鲜地黄指标性成分主成分分析均值分别为0.306 8、-0.183 8、-0.281 2，河南各地的平均分最高，山西产地的平均分最低。
　　3 讨论
　　本研究建立了鲜地黄中5种化学成分同时测定的HPLC方法，该法高效、准确、重复性好，能客观准确地反映出不同产地鲜地黄化学成分含量的差异，对于评价鲜地黄质量优劣具有一定的参考价值。多指标测定有利于更加全面地考察鲜地黄的药效物质基础，结合浸出物、多糖含量有利于更加全面、客观评价鲜地黄药材的质量。
　　本研究采用主成分分析法，通过变量之间的相关性减少变量将数据降维，将本试验所得的7个指标进行综合全面评价，从而有效地反映不同指标与鲜地黄质量的关系，更加全面客观地评价不同产地地黄品质差异。结果表明，不同产地鲜地黄差异明显，河南省的样品中地黄苷A、毛蕊花糖苷含量较高，河北省的样品地黄苷D含量较高，山西省的样品多糖含量较高，与各地环境气候及人为因素有关。经主成分分析，得出各产地鲜地黄综合质量为河南优于河北优于山西，这与地黄道地性相符，河北地区所用地黄种栽基本来源于河南省，因此质量优于山西省。
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