基于尿液代谢组学研究青蒿琥酯对庆大霉素诱导犬急性肾功能衰竭的保护机制

来源:用户上传      作者:朱道仙 陆江 郝福星 吴植

　　摘要：为观察青蒿琥酯对庆大霉素诱导犬急性肾功能衰竭尿液代谢物的调节作用及其机制。将24只泰迪型贵宾犬，随机等分为3组：对照组（control组）、肾衰组（CRF组）和青蒿琥酯组（ART组）。除对照组，其他组犬采用注射庆大霉素建立急性肾功能衰竭模型。然后，ART组给予青蒿琥酯，对照组和CRF组给予相同体积生理盐水。用生化分析仪测定肌酐（Cr）和尿素氮含量，用气相色谱-质谱法（GC-MS）测定尿液中的代谢物水平。结果显示，与CRF组比较，ART组血清Cr和尿素氮含量极显著降低（P<0.01）;共有14种代谢物水平发生改变，其中，α-酮戊二酸、色氨酸、酪氨酸、琥珀酸、花生四烯酸、苹果酸、柠檬酸及棕榈酸等含量降低;葡萄糖酸、牛磺酸、甘氨酸、肌酐、丝氨酸及甘油等含量升高。代谢通路分析发现共涉及三羧酸循环、甘氨酸代谢、酪氨酸代谢、色氨酸生物合成、谷胱甘肽代谢、甘油磷脂代谢及不饱和脂肪酸生物合成等7条代谢途径。以上结果表明，青蒿琥酯可有效改善庆大霉素诱导犬急性肾功能衰竭，可能与调节脂代谢、氨基酸代谢和能量代谢等通路有关。
　　 关键词：青蒿琥酯;庆大霉素;犬;急性肾功能衰竭;尿液代谢组学;代谢通路
　　 中D分类号：S858.292 文献标志码： A
　　 文章编号：1002-1302（2022）02-0137-05
　　收稿日期：2021-05-07
　　基金项目：江苏现代农业产业技术体系建设项目（编号：JATS[2018]238）;江苏农牧科技职业学院校级课题（编号：NSF201706）。
　　作者简介：朱道仙（1978―），女，安徽寿县人，硕士，讲师，主要从事动物临床营养及代谢病研究。E-mail：331802901@qq.com。
　　通信作者：陆 江，硕士，副教授，主要从事动物临床营养及代谢病研究。E-mail：vetlj@163.com。
　　 犬的急性肾功能衰竭是由多种病因引起的肾功能快速下降而出现的以氮质血症为特征的一种临床综合征，近年发病率逐渐升高。目前，常采取对症治疗、纠正酸碱平衡紊乱、维持残肾功能等方法进行治疗，效果不一，部分动物病情恶化甚至死亡，尚无有效的治疗方法。研究报道，对急性肾功能衰竭进行早期干预可降低肾功能进一步恶化的风险[1-2]。青蒿琥酯（artesunate，ART）具有抗氧化应激、抗炎、抗肿瘤及免疫调节等作用[3]。大量研究表明，ART对多种原因引起的肾损伤具有保护作用[4-5]，然而其作用机制尚不明确。代谢组学是研究细胞、组织、器官或整个生命有机体代谢物（相对分子质量在1 000以下）的组成及这些代谢产物在内外因素刺激下动态变化的一门科学[6]。由于代谢组学侧重于反映生物体内真实的病理生理变化状态，对药物干预后的作用趋势具有指导意义，目前代谢组学技术已在各系统疾病的研究中广泛应用[7]。因此，本研究拟采用气相色谱-质谱法（GC-MS）的尿液代谢组学检测方法，探讨青蒿琥酯对庆大霉素诱导急性肾功能衰竭模型犬的干预作用，以期阐明青蒿琥酯防治犬急性肾衰竭的作用机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验动物
　　泰迪型贵宾犬，约4岁，体质量（7±1） kg，雄性，江苏农牧科技职业学院宠物美容犬房提供。
　　1.2 试验设计
　　于2020年5月，选取24只泰迪型贵宾犬饲养于江苏农牧科技职业学院实验动物房，随机等分为3组：对照组（control组）、肾衰组（CRF组）和青蒿琥酯组（ART组）。所有犬均以商品化成年犬粮（冠能成年犬犬粮，规格12 kg/袋，雀巢普瑞纳宠物食品有限公司）进行7 d适应性饲喂后，除对照组，其他各组犬参考张萍等的方法[8]，每天09：00按照 40 mg/kg 体质量肌肉注射硫酸庆大霉素注射液（购于天津药业焦作有限公司），连续注射5 d，若血清肌酐（Cr）含量及临床症状无明显变化，则按 40 mg/kg 体质量间隔12 h重复给药，直至Cr含量>270 μmol/L，尿素氮含量升高，停止用药，犬急性肾衰模型建立成功。对照组给予等量生理盐水作为对照。然后，ART组犬按1 mg/kg体质量肌肉注射青蒿琥酯注射液（购于哈尔滨市宏达动物药品厂），CRF组和Control组给予等量生理盐水，1次/d，连续5 d。
　　1.3 血液肾功能指标测定
　　分别于慢性肾衰造模前（0 d）、造模后（7 d）和试验结束（12 d）时的08：00，空腹经头静脉采集各组试验犬的血液并制备血清，用M149928-全自动干式生化分析仪测定血清肌酐和尿素氮含量。
　　1.4 GC-MS法检测尿液代谢物
　　1.4.1 尿液采集 试验结束时，经膀胱穿刺收集新鲜尿液后迅速置于-80 ℃保存，待测。
　　1.4.2 尿样处理 参考孟欣等的方法[9]，将“1.4.1”节保存的尿液室温下融化后，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min后取上清液。取上清液200 μL，加入20 μL脲酶，混合均匀于37 ℃培养箱中孵化反应 20 min，加入 800 μL 冰冷色谱级乙醇，4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min，吸取200 μL上清液转入高回收率玻璃衍生小瓶中，采用温和氮气吹干提取液。向干燥物中加入30 μL 20 mg/mL盐酸甲氧胺吡啶溶液，37 ℃肟化反应90 min。取出后继续加入30 μL N，O-双（三甲基硅基）三氟乙酰胺（含1%三甲基一氯硅烷）的衍生试剂，密闭并于 70 ℃ 反应60 min。取出样本，室温放置30 min，进行GC-MS代谢组学分析。
　　1.4.3 GC-MS反应条件 GC-MS试验的仪器分析平台为安捷伦7890A/5975C GC-MS系统，毛细管色谱柱为Agilent J&W Scientific公司的 HP-5 ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。程序升温条件：初始柱温60 ℃，保留1 min，以20 ℃/min升温至320 ℃，保留4 min。进样口温度250 ℃，四极杆温度150 ℃，高纯氦气作为载气，不分流进样，进样量1.0 μL。质谱条件：电离方式EI，碰撞能量为70 eV，离子源温度280 ℃，离子传输线温度250 ℃，溶剂延迟时间为4 min，扫描方式为全扫描，质谱检测范围为50～600质荷比（m/z）。
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