纤维素降解菌的分离、鉴定与产酶条件探究

来源:用户上传      作者:�耸だ� 邹莎莎 吴书云 王成湘

　　摘 要 从林下腐熟土壤中筛选可降解纤维素的天然微生物，经过初筛、复筛得到降解能力较强的菌株DT13，革兰氏染色和分子生物学鉴定结果显示该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtillis DT13）。以羧甲基纤维素酶活性（Carboxymethyl Cellulase Activity，CMCA）为指标，设计单因素试验与正交试验对菌株DT13产纤维素酶条件进行优化，确定其最佳产酶条件为初始pH值7.0、发酵温度40 ℃、发酵时间96 h。
　　关键词 芽孢杆菌;羧甲基纤维素酶活性;发酵条件;酶活测定
　　中图分类号：Q93 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.02.007
　　纤维素是植物细胞壁的主要成分之一，是自然界中现有数量最多且最低廉的资源，目前尚未得到充分合理的利用[1]。在自然状态下，纤维素的生物降解主要通过微生物分泌的纤维素酶来完成，降解过程无污染、成本低，因而纤维素降解微生物的筛选一直受到研究者的关注[2-3]。自然界存在的产纤维素酶的微生物种类较多，对纤维素的降解能力差异较大，通过对其培养条件的优化可以有效提高产纤维素酶的效率和对纤维素的降解能力[4-6]。
　　1 材料与方法
　　1.1 土壤样品
　　多年自然生长松树林下充分腐熟的松针土，采集于贵州省镇远县。
　　1.2 培养基
　　富集培养基：K2HPO4 1.00 g・L-1、NaCl 0.10 g・L-1、MgSO4・7H2O 0.30 g・L-1、NaNO3 2.50 g・L-1、FeCl3 0.001 g・L-1、CaCl2 0.10 g・L-1。培养基按照每瓶50 mL进行分装，每个三角瓶中放入约0.50 g滤纸条，121 ℃灭菌20 min。
　　筛选培养基：（NH4）2SO4 2.00 g・L-1、MgSO4・7H2O 0.50 g・L-1、K2HPO4 1.00 g・L-1、NaCl 0.50 g・L-1、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）2.00 g・L-1、琼脂20.00 g・L-1，121 ℃灭菌20 min。
　　含刚果红的筛选培养基：在筛选培养基中加入2.00 g・L-1刚果红。
　　发酵培养基：蛋白胨3.00 g・L-1、酵母粉0.50 g・L-1、（NH4）2SO4 2.00 g・L-1、KH2PO4 4.00 g・L-1、CaCl20.30 g・L-1、MgSO4・7H2O 0.30 g・L-1，121 ℃灭菌20 min。
　　1.3 纤维素降解菌株的筛选
　　称量1.00 g土壤样品，在30 ℃ 150 r・min-1富集培养基中振荡培养至滤纸条完全裂解。用无菌水连续稀释培养后的富集培养基，得到10-7稀释液，取稀释液200 μL均匀涂布到含刚果红的筛选培养基上，30 ℃恒温培养，待菌落长出后，挑选培养特征不同且具有明显透明圈的单菌落转接到筛选培养基，纯化后冷冻保存。将纯化后的菌株转接筛选培养平板，30 ℃恒温培养24 h。用0.5%的刚果红溶液染色60 min，再用
　　1 mol・L-1 NaCl溶液褪色60 min，观察染色后的透明圈大小。选择透明圈直径（D）/菌落直径（d）比值较大的菌株，接入发酵培养基，30 ℃ 150 r・min-1培养72 h，测定培养液的羧甲基纤维素酶活性（CMCA），选择CMCA最高的菌株，进行下一步试验。
　　1.4 纤维素降解菌株的鉴定
　　1）形态学鉴定。接种菌株到筛选培养基培养24 h，观察菌落培养特征，进行革兰氏染色。
　　2）分子生物学鉴定。将培养24 h的纯化菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司M行鉴定，利用细菌16S rDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）、1492R（5'-TAGGGTTACCTT GTTACGACTT-3'）
　　对菌株16S rDNA序列进行扩增，对PCR产物纯化回收后测序，利用BLAST软件将测序结果与GenBank中已有序列进行比对，使用MEGA-X软件构建系统发育树，确定菌株的种属。
　　1.5 发酵条件对纤维素降解菌株产纤维素酶的影响
　　1.5.1 单因素试验
　　选取发酵时间、发酵初始pH值和发酵温度进行单因素试验，研究各因素对筛选出的菌株产纤维素酶的影响。将筛选出的菌株接种到一定初始pH值的发酵培养基中，在指定温度下150 r・min-1振荡培养一定时间，将发酵液3 000 r・min-1离心10 min，得粗酶液。测定单因素条件下粗酶液的CMCA确定合适的正交设计参数。每个处理设3个重复组。
　　1.5.2 正交优化
　　依据单因素试验结果，选择发酵时间、初始pH值和发酵温度，设计3因素3水平正交试验，采用L9（33）正交表。
　　1.6 纤维素酶活性的测定
　　纤维素酶活性用DNS法进行测定[6]。在特定条件下，1 mL粗酶液1 min转化产生1μg还原糖所需的酶量规定为1个酶活力单位（U）。取0.50 mL粗纤维素酶溶液、1.00 mL柠檬酸缓冲液（pH=4.8）和1.50 mL CMC-Na溶液充分混匀，50 ℃ 150 r・min-1酶解180 min，之后加入3.00 mL DNS溶液，充分混匀后沸水浴5 min，冷却后加入3.00 mL蒸馏水，充分混匀后在540 nm处测定吸光值。同时，设置底物空白和酶空白。
　　1.7 葡萄糖标准曲线的制作
　　向干燥试管中分别加入1.00 mg・mL-1标准葡萄糖溶液0.00 mL、0.30 mL、0.60 mL、0.90 mL、1.20 mL、1.50 mL，再分别加蒸馏水至体积为1.50 mL，加入DNS

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