甲醛与戊二醛固定剂对基于LudoxCQPS染色方法的研究结果对比

来源:用户上传      作者:王苗勋 许媛

　　关键词：多样性;群落结构;微型底栖动物;纤毛虫;固定剂
　　0引言
　　微型底栖动物个体微小且为单细胞，在海洋微食物环中扮演着重要的角色.其虫体脆弱，在离心分离过程中极易破碎.因此，如何有效地将其从沉积物中分离、固定并染色，成为微型底栖动物生态学研究的技术瓶颈[1-3].徐奎栋等改进的密度梯度离心结合定量蛋白银染色法（LudoxDensityGradientCentrifugationCombinedwithQuantitativeProtargolStaining，LudoxCQPS）是研究微型底栖动物生态学的重要手段[4-5]，并被纳入了《海洋微型底栖生物调查规范》[6]中.
　　样品固定是影响LudoxCQPS及后续统计分析的重要因素.理想的固定方法应尽可能少地引起细胞损失以及形态变化，能够真实地反映微型底栖动物的生活状况[7].固定方法不当，会导致部分物种丢失或形态破坏，不仅给鉴定造成困难，而且会导致对生物量的评估产生偏差，影响统计的准确性及对群落组成和多样性的分析[8-9].常见的固定剂类型有甲醛、戊二醛、鲁哥氏液（Lugol’s）和波恩液（Bouin’s）等，种类繁多，性能也存在很大的差异[10].类彦立等[4]和Xu等[11]比较了2%戊二醛、4%甲醛、10%Lugol’s液与5%Bouin’s液，认为酸性固定液（Lugol’s液与Bouin’s液）会引起Ludox胶体的凝结，降低固定液的固定效能，不适合LudoxCQPS研究[4，11]，pH值为中性的甲醛溶液与戊二醛溶液恰好满足其条件.已有的《海洋微型底栖生物调查规范》建议使用终浓度为2%的戊二醛固定底栖纤毛虫样品[6]，但由于戊二醛固定的样品存在长距离运输受限的问题，使得在大地理尺度上进行微型底栖动物的研究受到限制.而经甲醛固定的样品在满足一定条件下可以通过航空托运运输，因此可满足实验样品的远距离运输要求[12].
　　前人针对浮游类群的研究，发现固定剂类型及浓度会引起部分个体的损失及形态变化，进而影响对生物量的估计[13].Turley等[14]在研究中发现戊二醛固定的浮游生物的数目会随时间减少，并进一步证实了无论甲醛固定还是戊二醛固定均会引起细胞数量的损失.Choi等[15]发现戊二醛固定引起鞭毛虫虫体的收缩小于甲醛固定，而对于寡毛类纤毛虫而言，甲醛固定引起的收缩反而小于Lugol’s和戊二醛等固定剂.已有的文献[10，16-18]也提到，甲醛是相对于其他固定剂（如戊二醛）对细胞体积影响最小的.曾钰婷[19]对台湾地区近海经甲醛固定及室内培养的浮游纤毛虫结合定量蛋白银染色研究发现，甲醛固定不影响“属”级的鉴定，部分能够鉴定到“种”级.上述研究均源自浮游样品或室内培养的有限种的分析结果，而对于底栖类群的报道甚少.迄今，国内外针对固定剂类型对底栖类群影响的研究十分有限，仅有孟昭翠等[20]对采自黄海海域并经甲醛固定的底栖生物样品的研究，发现底栖鞭毛虫会随固定时间延长而造成一定数量的低估.
　　因此，为对比甲醛固定与戊二醛固定经LudoxCQPS染色后的微型底栖动物群落的研究结果是否具有可比性，本研究于2019年4月在上海南汇边滩采集了3种生境的微型底栖动物样品，并分别采用甲醛和戊二醛作为固定剂，后期进行LudoxCQPS染色实验并对比实验结果.这为以后采用何种固定剂进行微型底栖动物生态学研究及采用不同固定剂的研究结果是否具有可比性提供相应的研究依据.
　　1材料与方法
　　1.1 采样区域、方法及固定方式
　　本研究于2019年4月在上海市南汇边滩（30°51′39″N，121°55′06″E）选取光滩、海三棱草滩以及沙滩3种生境（图1），每种生境随机选取两个样点作为平行样.
　　使用直径约1.5cm的自制采样器，在每个样点随机采集6个表层平行芯样（0～2cm，约24mL），随机分成2组（每组3个芯样），一组使用终浓度1%的甲醛溶液固定，另一组使用终浓度2%的戊二醛溶液固定.
　　1.2 LudoxCQPS及物种鉴定
　　LudoxCQPS实验过程参照《海洋微型底栖生物调查规范》，依次对样品进行稀释降盐、密度梯度离心、真空抽滤、琼脂包埋、蛋白银染色、脱水与封片等过程，获得永久装片[6].
　　使用光学显微镜（BX53，OLYMPUS，日本）在200～1000倍下进行镜检，对目标生物测量长（L）和宽（D）[6].参照宋微波等[21]、Carey[1]和Lynn[22]等分类文献对纤毛虫进行鉴定，并根据各自特征进行类群划分.
　　1.3 纤毛虫生物量的计算
　　通过镜检测量纤毛虫个体的长（L）和宽（D），并根据虫体最接近的几何形状计算体积（V），通过转换系数对纤毛虫的生物量进行估算.一般每种纤毛虫随机选取20只个体（如果个体不足20只则全部计数）进行测量，最后取平均值[5，23].甲醛固定样品的转换系数为0.14pg/μm3，戊二醛固定样品的转化系数为0.20pg/μm3[5，24].
　　1.4 数据分析
　　利用PrimerCE7.0软件对纤毛虫丰度数据进行平方根转换，并计算BrayCCurtis相似性矩阵，在DIVERSE模块中计算物种数（S）、个体数（N）、香农C维纳多样性指数（H'）和均匀度指数（J'）.公式如下：
　　对底栖纤毛虫群落的物种组成、多样性参数及生物量数据在0.05水平上进行ANOSIM（AnalysisofSimilarities）双因素（生境类型和固定剂类型）交叉分析[25].并根据BrayCCurtis相似性矩阵进行NMDS（NonmetricMultidimensionalScaling）分析，以@示不同固定剂、不同生境采集的底栖纤毛虫群落物种组成的相似性.
　　2结果
　　2.1 物种组成

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