山羊附红细胞体部分生物学特性研究
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作者:王利娟
摘要：试验选择发热、贫血、黄疸症状明显的山羊，通过鲜血压片、血液涂片染色镜检和电镜观察等方法对山羊附红细胞体形态学、运动学和染色特性等生物学特性进行研究。结果表明，鲜血压片后光镜下观察，山羊附红细胞体向任意方向作翻转、扭转运动。姬姆萨氏染色和瑞氏染色后光镜下观察，红细胞分别被染成蓝色和粉红色，附着在红细胞上的山羊附红细胞体都被染成紫红色，且具有折光性;改良瑞氏染色后光镜下观察，红细胞被染成深紫色，山羊附红细胞体被染成紫红色;吖啶橙染色后光镜下观察，红细胞被染成暗绿色，山羊附红细胞体被染成发明亮荧光的绿色小体。
关键词：山羊附红细胞体;病原学;治疗;体外杀灭
中图分类号：S858.27文献标识码：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2022.01.004
Study on Some Biological Characteristics of Eperythrozoon Goat
WANG Lijuan
（Shandong Weifang Hanting District Animal Husbandry Development Center，Weifang Shandong 261100，China）
Abstract：In this experiment，goats with obvious symptoms of fever，anemia and jaundice were selected，the morphological，kinematic and staining characteristics of goat eperythrozoon were studied by means of microscopic examination and electron microscopy. The results showed that the goat eperythrozoon was turning and twisting in any direction. After GIEMSA's staining and Wright's staining，the red blood cells were dyed blue and pink respectively，and the eperythrozoon attached to the red blood cells were dyed purple-red with refraction The red blood cells were dyed deep purple and the goat eperythrozoon was dyed purplish red under the light microscope after the improved Wright's staining，and the red blood cells were dyed dark green under the light microscope after the acridine orange staining，the goat eperythrozoon is dyed into a bright fluorescent green body.
Keywords：goat eperythrozoon，etiology，treatment，in vitro killing
0引言
附t细胞体病是由附红细胞体引起的动物的一种热性、溶血性的疾病。常呈隐性感染，临床特征一般表现为发热、贫血、腹泻、消瘦和黄疸。该病易与弓形体等疾病一并发生，给诊断带来较大的困难，有必要对附红细胞体的生物学特性进行研究，建立一套实用的从山羊附红体病原特性着手的诊断方法。
1材料
1.1试验试剂
肝素钠、碘、姬姆氏色素、瑞氏色素、吖啶橙、氯化钙。
1.2试验仪器
生物显微镜、高速台式离心机、离心机、电热恒温水浴锅、普通冰箱、分析天平、蒸汽灭菌器、型超声波清洗器、荧光显微镜。
1.3溶剂
0.067 mol/L pH值为6.0的PBS液（磷酸盐缓冲液）：取23.87 g NaHPO加纯化水至1 000 mL 为a液（0.067mol/L NaHPO）;取10.40 g NaHPO加纯化水至1 000 mL为b液（0.067 mol/L NaHPO）。取a液70 mL ，加b 液430 mL，用pH计测其pH值。pH值<6.0加a液校正，pH 值>6.0则加b液校正，滴定至pH值为6.0。
0.01 mol/L pH值为7.2的PBS液：称取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.1 g NaHPO、0.2 g KHPO，加纯化水溶解并定容至1 000 mL，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl调整pH值为7.2。高压灭菌后4 ℃保存。
0.1%肝素钠：称取0.1 g肝素钠，加0.01 mol/L pH值为7.2的PBS液至100 mL即可。
0.1%碘溶液：称取1.0 g I，2.0 g KI。先加少量纯化水使I完全溶解，再用纯化水定容至1 000 mL，高压灭菌后备用。
0.1 mol/L CaCl溶液：称取CaCl2 11.1 g，加纯化水溶解并定容至1 000 mL，高压灭菌后备用。
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姬姆萨染色液：分别取姬姆萨氏粉0.5 g、甘油2.5 mL、甲醇2.5 mL。把姬姆萨氏粉放入乳钵，研溶在少量甘油中，再把全部甘油加进去，倒入烧瓶内，放在60 ℃水浴锅中水浴2 h，并不断摇晃搅拌，使其完全溶解，再加入甲醇后混匀过滤，放置2～3周后再过滤1次。临用时取原液加入去离子水中作10倍稀释。
瑞氏染色液：分别取瑞氏染剂粉0.2 g，甲醇97 mL，甘油3 mL。将瑞氏染剂粉加入甘油中充分研磨，然后倒进去少量甲醇，研磨后倾倒入瓶内，再分多次用甲醇冲洗研钵中的甘油溶液，倒入瓶内。摇匀，24 h后过滤待用，一般1～2周后再过滤。
改良瑞氏染色液：取瑞氏染色粉0.6 g，姬姆萨氏染色粉1 g，一起放进研钵内，再加入甘油10 mL充分研磨，然后倾入有色瓶中，加甲醇500 mL混匀，可立即使用。
0.01%吖啶橙PBS液：取0.1 g吖啶橙溶于100 mL 纯化水中，置4 ℃冰箱保存，配成原液，取其1份，加0.067 mol/L pH值为6.0的PBS液9份配制，置4 ℃冰箱保存。
2方法
2.1运动学试验
2.1.1 血液悬滴镜检
颈静脉无菌采集感染山羊血液，肝素钠抗凝，滴1 滴于载玻片上，加2～3倍生理盐水稀释以降低血液浓度，轻轻盖上盖玻片，在油镜下观察山羊附红体的形态特征及其活动状况。
2.1.2稀盐酸作用试验
取感染山羊抗凝血1滴放在载玻片上，再加1滴0.1% 稀盐酸溶解红细胞，于油镜下观察山羊附红体的运动状态。
2.1.3氢氧化钠作用试验
取感染山羊抗凝血1滴于载玻片上，再加1滴2.0%氢氧化钠溶液，作用5 s后，用盖玻片覆盖，油镜下观察山羊附红体的运动状态。
2.1.4碘制动试验
用生理盐水洗涤抗凝血，放在离心机上以1 500 r/ mm的转速离心15 min，除去上清液和中间的白细胞层，再把剩下的红细胞用生理盐水洗涤3次，然后加入少许生理盐水置65 ℃水浴锅中脱离2 min，3 000 r/min离心10 mm，取上清液置于显微镜下，滴上1滴0.1%碘液，肉眼观察山羊附红体的运动情况。
2.2染色特性试验
2.2.1姬姆萨氏染色
制作血涂片，涂片先自然晾干，然后用甲醇固定2～3 min，接着再加入姬姆萨染液染色15～30 min，最后水洗，放室温干燥后显微镜下检查。
2.2.2瑞氏染色
取洁净的载玻片，在其右端1/3处蘸血1滴，制成血涂片，干后加瑞氏染液染色1 mm，再加相同量的0.01mol/L PBS液（pH值为6.4）混合均匀，染色3～5 min，最后再水洗，放室温下干燥后显微镜下检查。
2.2.3瑞氏-姬姆萨混合染色
制作血涂片，把血涂片自然晾干后用瑞氏液将涂膜面均匀覆盖，稍等一会儿后再加入姬姆萨液，使得膜表面上的染色液形成表面张力，再加终止染色液，染色30～40 min，用水冲洗3 min，晾干后显微镜下检查。
2.2.4吖啶橙（Acridine Orange，AO）染色
血液涂片自然干燥，用甲醇固定10 mm，待其干燥后用0.067 mol/L pH值6.0的PBS液滴洗，使之湿润，然后用0.01%吖啶橙PBS滴加到涂片上浸染3 mm，用0.1 mol/L CaCl滴片分色45 s，倾去液体，用0.067 mol/L PBS液滴洗后加盖玻片，在荧光显微镜下用吸收波长405 nm，发射波长600 nm观察山羊附红体染色特性，并做阴性对照。
3结果与分析
3.1运动学试验结果
3.1.1血液悬滴镜检结果
山羊附红体在血液压片中可呈现多形性，有点状、圆形、杆状、月牙形、球状、星状、亚铃状等，大小一般为0.3～0.8 μm，在血浆中可做旋转、伸展、前后等运动，附在红细胞表面会停止运动，会使得红细胞发生振动。油镜下观察，形状好似空泡。红细胞失去原有的双凹形和表面光滑的形态特点，呈现不同的形状，随着感染率的增高，红细胞由近似圆形变成齿轮状、菠萝状、桑椹状和星芒状。
3.1.2稀盐酸作用试验
滴加1滴0.1%稀盐酸后，游离的山羊附红体增多，而且山羊附红体不受到红细胞溶解产生的影响，活性越发表现增强，并出现左右摆动、迅速旋转、扭转、颤动、上下沉浮等不规则运动。
3.1.3氢氧化钠作用试验
滴加1滴2.0%氢氧化钠后，油镜下观察到，山羊附红体部分溶解，山羊附红体开始表现出如滴加稀盐酸一样的特点，活动性增强，然后逐渐减弱，直至停止运动。
3.1.4碘制动试验
在油镜下可观察到大量的山羊附红体做摆动、旋转、上下沉浮等运动，滴加0.1%碘液后，山羊附红体在活染的过程中逐渐停止运动，不被碘着色。如再用生理盐水洗涤后，山羊附红体的活力也不再恢复。
3.2染色特性试验结果
3.2.1姬姆萨氏染色镜检结果
红细胞呈蓝色，感染山羊附红体的红细胞边缘不整齐，呈锯齿形、多边形或星芒状，同时存在一些红细胞的碎片;山羊附红细胞体表现为紫红色，可单个附着在红细胞上，也可多个附着在红细胞上，形态不太一样，有的呈月牙形、圆形、短棒状，也有的呈环形、逗点状等。调节微调，可见山羊附红体折光性强，外周有一白环，形似气泡。
3.2.2瑞氏染色镜检结果
瑞氏染色后在油镜下观察，红细胞呈粉红色，山羊附红体呈紫红色，大多数山羊附红体近似圆形。调节微调，可见山羊附红体折光性强，外周有一白环，形似气泡。
3.2.3改良瑞氏染色镜检结果
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改良瑞氏染色后在油镜下观察，红细胞被染成深紫色，山羊附红体被染成紫红色。
3.2.4吖啶橙染色镜检结果
在荧光显微镜下观察，红细胞呈现为暗绿色，山羊附红细胞体表现为发明亮荧光的绿色小体。在大多数红细胞边缘以及表面上会看到一些明亮的小体，其大小与姬姆萨染色所观察到的相近，为被吖啶橙染色的山羊附红体，而吖啶橙染色的阴性对照组，红细胞形态比较完整，边缘并没有发绿色荧光的小体。
4讨论
4.1山羊附红体的运动学特性
附红体是一种寄生在红细胞表面或者分散在血浆中的病原体。崔君兆等[1]在高热的病人和病畜血液内发现了一种不明微生物，认为其具有活泼的运动性，这就给后人了解附红体病原体带来了困扰，不利于此病的诊断、治疗以及预防。
本试验在血液悬滴镜检中未发现这种不明微生物，同国内大多数学者一样观察到附红体能在血浆中作慢速的升降和进退、多方向扭曲、伸屈等运动。一旦附红体附于红细胞后运动停止，当红细胞上附着的附红体数量较多时，有时能看到红细胞的轻微晃动，这与任峰[2]学者报道一致：附红体分为2类，一类在血浆中存在，个体较小，有运动性，称为球状附红体;一类附着在红细胞上，个体较大，无运动性，称为附红体。滴加1滴0.1%稀盐酸后，游离的山羊附红体增多，而且山羊附红体不受红细胞溶解的影响，活性反而明显增强;滴加1滴2.0%氢氧化钠后油镜下观察到，山羊红细胞部分溶解，山羊附红体开始表现如滴加稀盐酸一样活动性增强，然后逐渐减弱，直至停止运动;滴加0.1%碘液后，山羊附红体在活染的过程中逐渐停止运动，并不被碘着色，如再用生理盐水洗涤，山羊附红体的活力也不再恢复，这一特性具有鉴别作用。
4.2山羊附红体的染色特性
临床上对山羊附红体病的诊断通常采用的是血液悬滴镜检或者血液涂片染色镜检的方法，但是容易出现假阳性的结果，从而造成误诊的现象。经过反复多次试验论证，造成假阳性结果的原因主要为：一是在采集血样、制片、染色的过程中，所使用的试剂不合适，操作过程中各种细节不够规范等人为的因素;二是在高热病畜的血液中存在小新菌[3]，大小与山羊附红体相似，导致假阳性结果。为了尽量避免假阳性结果的出现，采集血样时要做到无菌、无污染，采用恰当的抗凝剂抗凝，例如1%肝素钠，否则造成正常的红细胞变形，错判为山羊附红体造成的红细胞变形;涂片时，血膜厚薄要适宜;染色时，将血片直立在染色缸中染色;油镜下观察时，在一张血片的片头、片中、片尾^察，严格按照病原的大小、染色特征，在形态正常的红细胞表面上看到山羊附红体就可以作为病原确诊的依据。
试验采用的四种染色方法都可以使山羊附红体着色，但是优缺点不一。瑞氏染色法和姬姆萨氏染色法是临床上诊断山羊附红体病常用的染色方法，姬姆萨氏染色法的优点是着色效果比较好，只是染色的时间较长，不太适用于快速诊断山羊附红体，而瑞氏染色法的优点是比较简单、快速，缺点是通常会出现一些颗粒，从而影响观察结果。改良瑞氏染色法集前两者优点于一身，能够在同一血涂片中看到各种不同的色彩，效果明显，建议作为首选的诊断方法向全国进行推广。吖啶橙染色山羊附红体会出现2种不同荧光，一种橘红色荧光体，另一种淡绿色。该染色方法比前三者具有更高的敏感性，但是用吖啶橙染色时核仁和核碎片也会发出荧光，所以血涂片最好是在采样现场制作比较合适，同时需要做阴性对照，避免出现假阳性的现象。总之，对于同一病例，应根据不同需求采取不同染色方法以提高对山羊附红体病诊断的准确率。
5结论
鲜血压片后光镜下观察，山羊附红体具有运动性和碘制动性，该特性对附红细胞体病和其他动物疾病具有鉴别诊断的作用。对同一病例，根据山羊附红体的运动学及在姬姆萨氏和瑞氏染色镜检的基础上，联合采用改良瑞氏染色和吖啶橙染色镜检能够提高山羊附红细胞体的检出率，使诊断结果更加准确，同时有针对性地用药，从而取得良好的治疗效果。
参考文献
[1]崔君兆，陆宙光，张丽华，等.在人和动物血液中发现一种不明微生物[J].兽医科技杂志，1982（2）：53-54.
[2]任峰.两种猪附红体病的鉴别诊断[J].中国兽医科技，1999，5（29）：12.
[3]尚德秋.附红体病的研究进展[J].中华流行病学杂志，1994，15（4）：234-240.
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