基于网络药理学和分子对接研究丁香抗流感的作用机制
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作者:何紫凝 袁中文 冯森玲
摘要 目的：探讨丁香抗流感的作用机制。方法：利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）和既往文献筛选丁香活性成分。通过数据库SwissTarget Predictiont获得丁香活性成分的相应靶点;采用GeneCards数据库获取流感相关靶点。将二者取交集，获得共同靶点，运用Cytoscape 3.7.2构建“丁香-活性成分-靶点-疾病网络”。运用String数据库构建共同靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。利用Metascape进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。用Autodock Vina 1.1.2对丁香活性成分与流感关键蛋白和流感病毒蛋白进行分子对接，并构建其作用网络。结果：从丁香-活性成分-流感靶点-流感网络中获得rhamnazin-3-O-β-D-glucopyranoside、isoquercitrin、quercetin-3-O-β-D-glucuronide、rhamnetin-3-O-β-D-glucuronide-6″-methyl、1，2，3，6-tetra-O-galloylglucose等28个丁香活性成分和MAPKs、TNF、AKT1、TP53、EGFR、CASP3、HSP90AA1等209丁香治疗流感的靶点。GO富集分析和KEGG富集分析结果显示，丁香治疗流感主要与激活免疫反应，调控酶活性、细胞凋亡、细胞因子等生物过程和调控PI3K-AKT、MAPK、细胞凋亡、趋化因子、甲型流感等信号通路有关。分子对接作用网络显示28个活性成分可与HA、NA、M2等多个流感病毒蛋白结合。结论：丁香可能通过多成分与多个流感病毒蛋白结合，并作用于多靶点，调控多通路，进而影响炎症反应、免疫应答、细胞凋亡和流感病毒复制，达到治疗流感的作用。
关键词 网络药理学;丁香;分子对接;流感;流感病毒;靶点;通路;机制
Anti-influenza Mechanisms of Flos Caryophylli（Clove） Based on Network Pharmacology and Molecular Docking
HE Zining，YUAN Zhongwen，FENG Senling
（Department of Pharmacy，The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University/Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province，Guangzhou 510150，China）
Abstract Objective：To explore the anti-influenza mechanisms of Flos Caryophylli（clove）.Methods：The active ingredients of Flos Caryophylli were screened through Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） and previous literature.SwissTargetPrediction was utilized to obtain the corresponding targets of the active ingredients of Flos Caryophylli.Influenza-related targets were searched out from GeneCards.The common targets were obtained by intersection.Cytoscape 3.7.2 was employed for the construction of “Flos Caryophylli-active ingredient-target-influenza” network.String was adopted to construct a protein interaction network（PPI） of the common targets.Gene ontology（GO） functional and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment analyses were performed by Metascape.Autodock Vina1.1.2 was used for molecular docking to study the interactions of the active ingredients of Flos Caryophylli with key influenza proteins and influenza virus proteins，and then their action network was constructed.Results：A total of 28 ingredients，such as rhamnazin-3-O-β-D-glucopyranoside，isoquercitrin，quercetin-3-O-β-D-glucuronide，rhamnetin-3-O-β-D-glucuronide-6″-methyl，and 1，2，3，6-tetra-O-galloylglucose and 209 targets of Flos Caryophylli in treatment of influenza，such as MAPKs，TNF，AKT1，TP53，EGFR，CASP3，and HSP90AA1 were obtained in the “Flos Caryophylli-active ingredient-target-influenza” network.Immune response activation，enzyme activity regulation，apoptosis regulation，cytokine regulation，and other biological processes were mainly related to anti-influenza by Flos Caryophylli from the GO functional enrichment screening，and PI3K-AKT，MAPK，apoptosis，chemokine，influenza A and other signaling pathways were involved from the KEGG pathway analysis.The molecular docking network showed that the 28 active ingredients could dock to multiple influenza virus proteins，such as HA，NA，and M2.Conclusion：Flos Caryophylli could interact with influenza virus proteins through multiple ingredients，and act on multiple targets and regulate multiple signaling pathways，which affected inflammatory response，immune response，apoptosis and influenza virus replication，and finally achieved the effect of inhibiting influenza.
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Keywords Network pharmacology; Flos Caryophylli（clove）; Molecular docking; Influenza; Influenza virus; Target; Pathway; Mechanism
中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.16.007
据美国疾病预防控制中心预测报告，自2019年10月至2020年4月有3 900～5 600万人感染流感，导致24 000～62 000人死亡[1]。流行性感冒（流感）是一种由流感病毒感染导致的急性呼吸道传染病，严重时可发展为急性呼吸窘迫综合征或多脏器衰竭，甚至引起死亡。目前主流的防治流感药物有生物疫苗、奥司他韦和扎那米韦等神经氨酸酶抑制剂、金刚烷胺类的M2离子通道抑制剂。但现有的抗流感药物容易产生耐药性，而且仅针对单一靶点，开发滞后，完全跟不上流感病毒高抗原漂移的速度，给抗流感药物的开发带来很大挑战[2]。近年来，我国中药及其复方发展迅速，研究表明中药不仅可以通过抑制病毒复制、抵抗病毒导致的细胞病变来治疗流感，还能通过调节机体免疫功能、改善肺循环、镇痛抗炎来治疗流感并发症[3]。因此，运用中药防治流感，开发抗流感药物，有其独特的优势。
丁香为桃金娘科植物丁香Eugenia caryophyllata Thunb.的干燥花蕾。具有温中降逆，补肾助阳的功效。主治脾胃虚寒，呃逆呕吐，食少吐泻，心腹冷痛，肾虚阳痿[4]。现代研究表明，丁香主要含有挥发油类、酚酸类、黄酮类、三萜类等成分，具有调节胃肠运动、抗胃溃疡、抗炎、镇痛、抗菌、抗病毒、抗癌等药理作用[5]。有研究证明，丁香具有抗流感病毒活性，但其抗流感病毒作用机制的报道较少，目前只知其能抑制神经氨酸酶而发挥抗流感病毒作用，但是否还存在其他机制仍不清楚[6]。网络药理学是基于生物信息学和系统生物学方法，通过构建“药物-靶点-疾病”网络，分析网络特征协同关系的新学科，近年来被广泛用于预测中药活性成分群和潜在靶点群，以阐述中药作用机制。
本研究拟采用网络药理学对丁香抗流感活性成分的相关靶点及信号通路进行分析，并运用分子对接实验研究丁香活性成分与流感病毒蛋白的结合作用，从分子水平、细胞水平和基因水平探讨丁香抗流感分子机制，为丁香的深入研究及开发利用，为抗流感药物的研发提供参考。
1 资料与方法
1.1 数据库与软件 数据库：中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、SwissTarget Prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、人类基因数据库（GeneCards）（https：//www.genecards.org/）、String数据库（https：//string-db.org/）、Protein Data Bank数据库（PDB，https：//www.rcsb.org/）、Metascape网站（http：//metascape.org/gp/index.html）;软件：Cytoscape 3.7.2、Autodock Vina 1.1.2、Ligplus等[7-13]。
1.2 丁香活性成分的收集和筛选 从TCMSP中以及文献补充检索丁香所有化学成分，然后筛选出其中生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18的丁香活性成分。
1.3 丁香活性成分靶点的预测 将筛选得到的活性成分输进数据库SwissTarget Prediction，研究物种为“Homo sapiens”，得到结果后，整合、去重，最后得到丁香活性成分对应的作用靶点。
1.4 流感疾病靶点的获取及丁香治疗流感的靶点预测 以“influenza”为关键词，物种为“Homo sapiens”，检索GeneCards，获得流感疾病相关靶点。利用Microsoft Excel将流感疾病靶点与丁香活性成分作用靶点进行映射，获得二者的共同靶点，即为丁香治疗流感的靶点。
1.5 构建丁香-活性成分-流感靶点-流感网络 运用Cytoscape 3.7.2软件，导入丁香活性成分和丁香治疗流感的靶点，构建网络“丁香-活性成分-流感靶点-流感”，通^Network Analyzer功能分析网络节点，度值的大小以节点的大小来代表。
1.6 构建和分析丁香治疗流感靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络 运用String数据库检索获得的丁香治疗流感的靶点，物种来源设为“Homo sapiens”，最小相互作用分值设为0.4，得到PPI信息，将其导入Cytoscape 3.7.2软件，绘制出PPI网络。利用Network Analyzer对其进行分析，计算网络中每个节点度值，筛选出度值高于2倍中位数的节点。然后运用插件CytoNCA对PPI进行网络拓扑分析，包括连接度、介度和紧密度等，筛选出连接度、介度和紧密度均高于中位数的节点作为核心节点。
1.7 基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 将所得的丁香治疗流感靶点录入Metascape平台，设置P<0.05，进行GO生物功能与KEGG富集分析，通过平台对数据进行可视化，以高级气泡图呈现。
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1.8 分子对接及其作用网络的构建 将丁香-活性成分-流感靶点-流感网络中的28个化合物和奥司他韦作为对接柔性配体，利用Chem Bio 3D Ultra 12.0构建化合物的3D结构，进行能量最小化，并保存为PDB格式。然后用Mgltools 1.5.6对化合物进行预处理，并转化为PDBQT格式。选取“丁香-活性成分-靶点-疾病”网络度值前15位与PPI核心网络的2个交集靶点和6个关键流感病毒蛋白作为对接刚性受体。从PDB数据库中下载受体靶蛋白的晶体结构（含原配体）。利用Pymol软件对各靶点晶体结构去水及自身配体，通过Mgltools1.5.6进行加氢，计算电荷，合并非极性氢等预处理，然后保存为PDBQT格式。以受体靶蛋白中原配体的中心点坐标设置对接的活性口袋区域，采用AutoDock Vina 1.1.2进行半柔性分子对接。取能量最低的构象为最优构象，用Pymol软件可视化分析作图。根据分子对接结果，以奥司他韦作为对照筛选出活性化合物，然后将其与流感相关关键蛋白导入Cytoscape 3.7.2软件，构建丁香化合物与流感相关关键蛋白作用网络。
2 结果
2.1 丁香活性成分的筛选收集 通过TCMSP平台检索到丁香117个化学成分，以OB≥30%，DL≥0.18为条件筛选到6个活性成分（Clove1-6）。结合文献补充TCMSP中并未收集的化学成分，同样将OB≥30%及DL≥0.18作为标准，筛选得到3个活性成分（W1-3）。另外，有19个化学成分（NA1-19）因其有抗流感病毒活性报道，虽不符合筛选条件，同样纳入研究。共获得28个丁香活性成分。见表1。
2.2 丁香治疗流感的靶点 共得到589个丁香活性成分作用靶点。获得2 506个流感疾病靶点。映射后得到209个共同靶点。
2.3 丁香-活性成分-靶点-流感网络 图1包括1个丁香，28个丁香活性成分，209个流感靶点，1个流感，共239节点和1 281条边。圆形代表丁香活性成分，正方形代表流感靶点。28个活性成分均能与25个以上的流感靶点相连接，度值排前5的活性成分分别为：Rhamnazin-3-O-β-D-glucopyranoside、Isoquercitrin、Quercetin-3-O-β-D-glucuronide、Rhamnetin-3-O-β-D-glucuronide-6″-methyl、1，2，3，6-tetra-O-galloylglucose。
2.4 丁香治疗流感靶点的PPI 利用String数据库，检索得到的209个丁香治疗流感的靶点，获得了包含207个节点，3 076条边的PPI网络，然后通过Cytoscape 3.7.2将网络可视化，并使用Network Analyzer功能分析，筛选出度值高于2倍中位数的节点，所得PPI网络有39个节点，610条边;再做进一步拓扑分析，筛选出连接度、介度和紧密度均高于中位数的18个节点，共150条边，构成PPI核心网络，网络中节点面积大小和颜色暖冷代表节点的重要性强弱。PPI核心网络靶点包括AKT1、GAPDH、TP53、MAPK3、TNF、EGFR、VEGFA、SRC、MAPK1、CASP3、HSP90AA1、HRAS、MAPK8、IL2、MAPK14等。而在丁香-活性成分-靶点-流感网络中，TERT、XDH、PRKCA、PTGS2、ADORA2A、PRKCD、PRKCB、SRC、ADRA2A、ADRA2C、HSP90AA1、PRKCE、NOX4、RPS6KA3、CD38均可c15个以上的活性成分相互作用，二者相互映射得到SRC、HSP90AA1 2个靶点。见图2。
2.5 GO生物功能和KEGG富集分析 得到2 366个GO生物过程（Biological Processes，BP）富集分析条目、117个GO细胞组分（Cell Components，CC）富集分析条目和214个GO分子功能（Molecular Functions，MF）富集分析条目。以前20个条目为主要分析对象。BP主要涉及对酶活性的调控、细胞因子介导的信号通路、MAPK级联的调控、细胞对化合物的反应，细胞迁移的调控、细胞对应激的反应、细胞死亡的调控、激活免疫反应等。CC主要涉及膜区、小窝、膜侧、囊泡腔、分泌颗粒内腔、溶解液泡、溶酶体等。MF主要涉及激酶和蛋白激酶结合与活性、磷酸转移酶和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、转录因子结合、细胞黏附分子结合、辅助因子结合、氧化还原酶活性、细胞因子受体。KEGG通路富集分析共得到173个条目，主要涉及癌症途径、PI3K-AKT信号通路、促分裂原活化的蛋白激酶（Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK）、乙型肝炎、Ras蛋白、细胞凋亡和趋化因子信号通路、T细胞受体信号转导通路、甲型流感、环磷酸腺苷信号通路、EB病毒感染等。见图3。图中横坐标表示富集因子，纵坐标表示通路，圆点大小表示基因数，圆点越大则基因的富集数越多;圆点颜色代表-log10（P值），值越大，颜色越明亮，此通路上富集的基因越多。
2.6 丁香活性成分与流感相关蛋白分子对接作用网络与分子对接模式 将“丁香-活性成分-流感靶点-流感网络”网络中的28个活性成分和奥司他韦与8个流感相关蛋白进行半柔性分子对接。见表2。以奥司他韦作为对照筛选，构建丁香活性成分与流感相关蛋白作用网络。结果显示，丁香活性成分对流感关键靶蛋白和流感病毒蛋白均有较好的结合作用。丁香中28个活性成分均能与流感病毒蛋白NA、HA、PB2对接，且大多还能与PA、NP、M2对接，还有11个成分能与M2对接，21个成分与NP对接，都优于奥司他韦。除NA3、NA4、CLOVE2外，其他成分均可与SRC结合，除NA6外，其他成分均可与热激蛋白90AA1结合，且都优于奥司他韦。其中NA6与NA，NA8与HA，CLOVE6与M2，NA12与PB2，NA7与NP，NA9与PA、热激蛋白90AA1、SRC的结合度最高。见图4。从分子对接模式图可以看出，大多化合物主要以氢键和疏水作用和受体位点结合，而且这些化合物大部分属于黄酮类和鞣质类。如NA6与NA中的Glu119、Glu227、Arg371等形成
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氢键，与Arg118、Glu277等形成疏水作用，加强了NA6与NA的相互作用。NA12与PB2中的Glu361、Lys376等形成氢键，与His357、Ser321等形成疏水作用，形成了稳定的结合构象。见图5。
3 讨论
本研究构建了丁香-活性成分-流感靶点-流感网络，共筛选出丁香防治流感疾病的28个活性成分、209个靶点。网络中度值前5位的化合物是rhamnazin-3-O-β-D-glucopyranoside、isoquercitrin、quercetin-3-O-β-D-glucuronide、rhamnetin-3-O-β-D-glucuronide-6″-methyl、1，2，3，6-tetra-O-galloylglucose。Isoquercetrin在体外和体内均能显著减少流感病毒的复制，还能通过抑制流感病毒神经氨酸酶和下调γ干扰素水平而发挥抗流感病毒作用[14-15]。
流感病毒在宿主细胞内进行复制增殖，最终通过多条凋亡途径激活下游胱天蛋白酶3，使细胞凋亡[16]。流感病毒NS1能使凋亡肽酶激活因子1与热激蛋白90AA1的相互作用减弱，并激活胱天蛋白酶3分解，减少细胞的过早凋亡，促使病毒在细胞内的增殖[17]。流感病毒入侵宿主后，经宿主能介导系列的天然免疫防御反应，如释放肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）发挥抗病毒作用[18]。TNF-α可上调核因子κB、MAPK等信号通路，引起机体炎症反应的发生，最后导致细胞凋亡。但是过度刺激天然免疫系统可能有害机体。研究表明，流感不是通过直接破坏呼吸道上皮细胞来引起病理损伤及死亡的，而是通过“细胞因子风暴”，TNF-α是引起急性肺损伤的核心细胞因子[19]。P53是细胞肿瘤抗原，在细胞感染后期，流感病毒可激发P53依赖和非P53依赖的细胞凋亡、坏死途径[20]。流感病毒先激活表皮生长因子受体，进而激活PI3K、MAPK等下游信号通路，促进对宿主的侵袭，增强自身复制[21]。因此，本研究显示，丁香可能通过AKT1、TP53、MAPK3、TNF、EGFR、CASP3、HSP90AA1等靶点调节人机体炎症反应、细胞凋亡等免疫应答以防治流感。
通过GO功能富集分析发现丁香可激活免疫反应、调控酶活性、细胞因子、细胞应激、细胞凋亡等生物过程。而KEGG通路富集分析表明丁香可能通过PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、乙型肝炎、细胞凋亡、趋化因子信号通路、T细胞受体信号转导通路、甲型流感等多条复杂的通路防治流感。研究发现，流感病毒感染的早期和中期，非结构性蛋白可以结合同时激活磷脂酰肌醇3激酶，或者与AKT1直接结合，磷酸化AKT1，使PI3K-AKT信号通路激活，抑制细胞凋亡，促使流感病毒的增殖和复制[22]。MAPK信号通路，包括胞外信号调节酶（Extracellular Signal-regulated Kinase，ERK）1/2、c-Jun末端激酶（JNK）、P38和ERK5 4种亚型。研究显示，流感病毒感染可同时激活4条MAPK通路。而MAPK家族对病毒核糖核蛋白（Viral Ribonucleoprotein，vRNP）的运输和病毒复制有促进作用。其中，在炎症反应中，P38 MAPK激活不可或缺，可调节流感病毒感染诱导产生的细胞因子。MAPK信号通路的激活还能诱导TNF-α、白细胞介素-2和白细胞介素-6等的表达[23]。
从丁香化学成分与流感相关蛋白分子对接作用网络图可知，28个成分均可与3个以上靶点结合，且各个靶点均能结合多个活性成分，这提示丁香抗流感病毒的多靶点作用，丁香除了能抑制NA，还能作用于HA、PB2、PA、NP、M2等多个流感病毒蛋白。由此推测，丁香可能是通过与NA、HA、M2等蛋白相互作用，影响流感病毒的吸附、脱壳、复制以及释放等过程，从而达到抗流感病毒作用。据研究报道，除了W3、CLOVE1、CLOVE2、CLOVE3、CLOVE5外，其他活性成分均有抑制NA、抗流感病毒活性的作用[6，24-26]。其中Luteolin（木犀草素）、Quercetin（槲皮素）和Kaempferol（山柰酚）还被实验证实分别能通过抑制HA、M2的表达从而抑制流感病毒活性[25-27]。
根据网络药理学分析，SRC和热激蛋白90AA1不仅为丁香多个化合物的靶点并且在PPI网络中具有重要地位，故用AutoDock Vina对丁香活性成分与SRC和热激蛋白90AA1进行分子对接。结果表明丁香活性成分与SRC（原癌基因酪氨酸蛋白激酶）、热激蛋白90AA1有较好的结合活性，推测丁香在人体内可能主要干预SRC、热激蛋白90AA1来治疗流感。
综上所述，本研究运用网络药理学和分子对接的方法探索丁香中化学成分、作用靶点以及主要活性成分与流感相关蛋白结合的能力。研究结果提示，丁香发挥防治流感的作用可能是通过多成分、多靶点、多通路的协同作用来实现的。本研究初步探索和预测丁香治疗流感的药效物质基础与分子生物学机制，为后续进一步验证其作用机制的实验研究提供了依据。
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（2020-11-16收稿 本文编辑：张雄杰）
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