基于聚苯胺有机半导体发展光电化学体系检测尿素
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作者:顾鑫鑫， 杨海峰， 吴一萍
摘 要： 聚苯胺（PANI）是一种导电性良好、光电转化效率高的p型有机半导体.采用旋涂法制备了聚苯胺/氧化铟锡（PANI/ITO）电极，然后通过静电吸附将脲酶（urease）固定在PANI/ITO表面，形成Urease/PANI/ITO复合电极.利用脲酶分解尿素（urea）产生的氨可以改变PANI膜质子化状态，从而影响其光电性能的原理，发展可特异性检测尿素的光电化学（PEC）方法.该方法对尿素的线性检测范围较宽（10-3～10-8 mol・L-1），特异性、稳定性和可重现性也较好，可用于人体尿液中尿素含量的测定.
关键词： 聚苯胺（PANI）； 光电化学（PEC）； 脲酶（urease）； 尿素（urea）
中图分类号： O 657.1 文献标志码： A 文章编号： 1000-5137（2022）05-0611-08
Development of a photoelectrochemical system based on polyaniline organic semiconductor for detection of urea
GU Xinxin， YANG Haifeng*， WU Yiping*
（College of Chemistry and Materials Science， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China）
Abstract： Polyaniline（PANI） is a p-type of organic semiconductor with good conductivity and high photoelectric conversion efficiency. In this work， a polyaniline/indium tin oxide（PANI/ITO） electrode was prepared by spin coating. Then， the urease was immobilized on its surface by electrostatic adsorption to form an Urease/PANI/ITO composite electrode. The fixed urease on the surface catalyzes urea decomposition to generate ammonia， changing the PANI film’s protonation state and further affecting its photoelectrochemical response. Based on this， a photoelectrochemical（PEC） method for the specific detection of urea was established. The technique has a broad linear detection range for urea（10-5-10-9 mol・L-1） and has reasonable specificity， stability， and reproducibility. It has been successfully used to detect urea content in human urine.
Key words： polyaniline（PANI）； photoelectrochemistry（PEC）； urease； urea
0 引 言
光化学（PEC）传感器通常由光源、识别元件、信号转换系统和信号采集系统组成［1］.它的工作原理是光电材料，通常是半导体或量子点，吸收特定波长的光后被激发，电子由价带（VB）跃迁至导带（CB），产生电子-空穴对；电子-空穴对与外界环境中的物质发生氧化还原反应，形成回路电流，由此确定光电信号与待测物之间的关系，实现光电检测［2］.光电材料在PEC传感器中至关重要，它不仅起到固定分子、产生和传输信号的作用，且决定着传感器检的检测灵敏度.无机半导体材料是目前PEC研究中使用最广泛的一类材料，主要包括金属氧化物、量子点和无机半导体纳米晶.这类半导体材料的优点是制备简便、形貌可控和化学稳定性相对较好；不足之处是电子-空穴复合率高，某些半导体材料（如ZnO、CdS）具有光腐蚀特性［3-4］，且带隙的稳定性和可调谐性较差等缺点.
血尿素氮是目前体检的必检项目之一，也是临床上最广泛应用于肾功能评估的血清标志物之一，其对心功能等方面的评估也起到一定的参考价值.成人正常血尿素氮水平约为3.2～7.1 mmol・L-1，婴儿及儿童约为1.8～6.5 mmol・L-1.慢性肾衰竭是指各种肾脏病导致肾脏功能渐进性不可逆地减退，直至功能丧失所出现的一系列症状和代谢紊乱所反映出的临床综合征.慢性肾衰的终末期即为尿毒症.美国国家健康和营养调查表明慢性肾脏病的患病率约为16%［5］.慢性肾脏病的主要后果之一是血液中代谢废物的水平显著增加，包括通常由肾脏排泄的尿素（urea）和肌酐（creatinine）［6］.在尿毒症患者中，尿素水平可以达到健康者的10倍，尿素从1.7～8.1 mmol・L-1上升到50～70 mmol・L-1 ［7］，因此尿素被认为是评估尿毒症患者毒素水平的最佳指标.目前尿素的测定方法有比色法、荧光法、气相色谱法、酶比色法/分光光度法和高效液相色谱法［8］.然而，这些方法存在样品前期处理耗时长、成本高和分析时间长等不足［9］.电化学方法因其仪器设备简单、响应速度快速、检测灵敏度高等优势，在生物化学分析中一直占据特殊的地位.电位法和安培生物传感是两种常见的尿素电化学测定方法［10］.这两种方法中，电位法因为选择性高，被认为是可以替代传统尿素测定方法的较好方案.在电位生物传感方法中，尿素被固定化尿素酶水解成铵根离子（NH4+）和碳酸氢根（HCO3-）离子，利用离子选择性测定NH4+或HCO3-的浓度即可确定尿素的浓度.在尿素生物传感器中，通常需要将尿素酶化学固定在不同的载体上.然而，酶的共价固定不可避免地会导致其生物活性部分丧失和稳定性变差.还有一些工作涉及繁琐的材料制备和修饰，这会大大提高传感器的使用成本和实际可利用性.
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导电聚合物中聚苯胺（PANI）、聚噻吩和聚吡咯是一种具有类似于半导体和金属等无机材料电性能的有机高分子材料，其制造成本低、加工性能好、机械柔性高和可功能化范围广，因此是无机材料理想的替代品.PANI导电性良好，且是所有导电聚合物中制造成本最低、热稳定性最好的［11］.与其他共轭聚合物相比，PANI还具有独特的氧化还原状态和掺杂机理.可以向PANI祖母绿碱中掺杂酸，得到导电祖母绿盐的结构，这两种状态下PANI的电导率会发生显著变化，且该过程可逆.PANI的这种可逆特性可用于检测许多酸性和碱性蒸汽［12］.此外，科研工作者还利用PANI可逆的氧化还原特性构建信号放大策略，实现对小分子、蛋白质和DNA的灵敏测定［13-15］.与传统的致密薄膜相比，纳米纤维形式的PANI具有更高的比表面积，生物兼容性也更好.它们可以通过共价等方式与各种有机和无机材料连接，以实现材料间的协同效应.例如，可以将单链DNA连接到附着在PANI纳米纤维上的金纳米颗粒上，以实现对金黄色葡萄球菌的检测［15］.
为了探究PANI在PEC传感器中的应用，通过旋涂法将PANI固定在氧化铟锡（ITO）电极表面，形成半导体膜，记为聚苯胺/氧化铟锡（PANI/ITO）.然后，在电极表面修饰聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA），通过静电吸附的方式将脲酶（urease）固定在PANI/ITO上.PANI可质子化，在与尿素分解产物NH4+结合后，其导电状态发生变化，从而引起自身光电流的改变.基于这一特性，构建了可以检测尿素的PEC传感器.
1 实验部分
1.1 验试剂
无水乙醇、丙酮、异丙醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、PANI（翠绿亚胺基）、尿素、磷酸缓冲液（pH值为7.2～7.6）均购自Sigma公司；脲酶购自阿拉丁试剂公司；ITO导电玻璃购于深圳伟光公司南玻有限公司.实验过程中用的水均由电阻率为18.25 MΩ・cm的超纯水配制而成，所有的试剂和化学品均直接使用，未经进一步分离提纯.
1.2 实验仪器
PEC反应仪（PEAC 200A型，天津艾达恒晟科技发展有限公司）；X射线衍射仪（XRD，Rigku XRD MiniFlex，日本理学公司）；电化学工作站（CHI 440C，上海辰华仪器有限公司）；台式匀胶机（KW-4A型，中国科学院微电子研究所）；透射电子显微镜（TEM，S-4800型，日本日立仪器有限公司）；紫外-可见分光光度计（UV-7504PC型，上海欣茂仪器有限公司）；干燥箱（DZF-6000，上海慧泰仪器制造有限公司）；纯水仪（Milli-Q，上海淼康实业有限公司）.
1.3 制备Urease/PANI/ITO复合电极
配置8 mg・mL-1的PANI前驱液：利用电子天平称量一定质量的PANI黑色固体粉末，加入合适体积的N-甲基吡咯烷酮，即得到8 mg・mL-1的PANI溶液；将所配置的溶液加入超声仪中室温超声1 h，制得深蓝色的PANI分散液.
制备PANI/ITO电极：将制备的PANI前驱液（70 μL）旋涂在预先洗净并烘干的导电ITO玻璃表面（5 cm×5 cm）；将电极放入烘箱于45 ℃烘干30 min；将干燥后的电极进行第二次旋涂，并再次进行烘干处理.最后得到的电极表面有一层深蓝色的透明薄膜.
制备Urease/PANI/ITO电极：配置质量浓度为3 mg・mL-1的PDDA，取70 μL均匀的滴涂在ITO表面（面积为1 cm×2 cm），于保湿盒中孵育12 h后取出，用去超纯水清洗2遍，氮气（N2）吹干.再将70 μL的脲酶（125 g・mL-1）滴涂在电极表面，孵育4 h后于摇床上用去超纯水清洗3 min，N2吹干备用.
1.4 电化学阻抗（EIS）表征
在CHI 440C电化学工作站上对电极进行EIS表征，以验证电极表面修饰是否成功.实验条件为：三电极体系，包括Urease/PANI/ITO为工作电极，银/氯化银（Ag/AgCl）为参比电极，铂（Pt）丝为辅助电极；阻抗液为5.0 mmol・L-1［Fe（CN）6］3-/4-溶液，其中含0.1 mol・L-1 KCl；振幅设置20 mV，低频设置0.1 Hz，高频设置100 000 Hz；整个EIS实验在安静的环境下完成.
1.5 PEC测试
检测系统为CHI 440C电化学工作站，激发光源为465 nm蓝光，光照时间设置10 s，停滞时间设置10 s，实验过程光源的启动和关闭全自动化进行；采用计时电流技术进行光电检测，Ag/AgCl为参比电极，Pt丝电极为对电极，电解液为0.01 mol・L-1 Tris-HCl（pH=7.2），偏压设置为-0.4 V.
2 结果讨论
2.1 PANI膜形貌表征
图1（a）是PANI粉末的TEM图，可以看到本征态PANI以无定形纳米颗粒的状态存在.图1（b）是PANI粉末XRD图，结果显示PANI粉末没有特定的衍射峰，而是在25.5°附近出现了一个宽峰，这与TEM下观察到的PANI呈无定形性纳米颗粒相一致［16-18］.图1（c）是PANI粉末的紫外可见光谱，结果显示PANI出现2处特征吸收，分别位于340 nm和635 nm处，分别由苯环的p-p*跃迁和电子向醌环的跃迁导致［19-20］.图1（d）是所制备的PANI/ITO电极的宏观图，可以看到涂敷在ITO基底表面的PANI薄膜呈透明深蓝色.
2.2 Urease/PANI/ITO电极电化学表征
EIS谱可以有效表征电极表面的修饰过程.图2（a）显示了PEC传感器构建过程中涉及的阻抗变化.阻抗图中半圆直径的大小可以反映电极内阻（Ret）的变化，半圆直径越大，代表Ret越大.因为PANI为有机半导体材料，ITO基底表面涂敷上该有机半导体膜后Ret增大；脲酶为生物大分子材料，导电性差，随着其在电极表面的固定，Ret进一步增大，电子传输能力再次下降.根据图2（a）可以观察到不断增大的Ret，表明PANI和脲酶在ITO基底表面固定成功.图2（b）是不同电极的光电响应，可以看到PANI膜在 -0.4 V的偏压下光电响应强，约为5 μA.该光电流为阴极光电流，代表PANI为P型半导体，光激发空穴在介带富集，电子由外电路流入电极.另外，当PANI/ITO电极表面组装脲酶之后，光电流显著下降，这可能是由于脲酶的固定阻碍了部分激发光的透过，Ret增大而导致的.
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2.3 检测条件优化
为了使传感器达到最佳性能，实验过程中，对光源和PANI膜的厚度进行了优化.光电测定在10 mmol・L-1 PB缓冲液（pH=7.2）中进行，图1（c）的紫外可见光谱表明PANI膜在400～700 nm波段都有吸收，所以在此波段内选择了相同功率下3种不同的光源进行优化.结果如图3（a）所示，PANI对光源为450 nm左右的蓝光响应最强.图3（b）是不同质量浓度PANI溶液制备的PANI膜的电流-电压（I-V）曲线，扫描电极的电压从-0.4 V～0.2 V.在蓝光的激发下，不同厚度PANI膜显示出整流特性，当PANI溶液为 8 mg・mL-1时，对应的半导体膜光电流响应趋于稳定.
图4显示不同质量浓度尿酶以及孵育时间对光电流的影响.由图4（a）可知，随着尿酶质量浓度的增加，光电流出现先增大后减小的现象.这可能是由于125 mg・mL-1的脲酶足以将所有尿素完全分解，使光电流的响应达到最大.进一步增加脲酶反而会使电极导电性变差，阻碍电子在电极表面的传输，引起光电流的下降.因此，在接下来的检测过程中，脲酶的质量浓度固定为125 mg・mL-1.图4（b）是脲酶和尿素孵育时间的优化，可以观察到40 min后光电流达到稳定，表明尿素完全分解.因此，尿素的最佳孵育时间为40 min.
2.4 尿素检测
确定好最优检测条件后，利用Urease/PANI/ITO电极对不同质量浓度的尿素进行了测定.由于PANI 的自然可逆去质子化过程，PANI的导电翠绿盐（ES）形式会转化为半导体翠绿碱（EB）形式，在这个过程中PANI由于本身状态的改变从而带来导电性的变化.检测过程中尿素会在脲酶的作用下分解产生NH4+，通过反应方程式（1）可以推测得到，产生的NH4+会将PANI中EB形式质子化为ES形式.根据上述分析可知，光电流响应与尿素的浓度呈正相关性，尿素浓度越高在脲酶作用下会产生的NH4+也越多，那么释放的质子将 PANI的亚胺质子化，更多转换为ES形式，带来较强的光电流信号［21］.
PANI-NH+（ES）+NH3PANI（EB）+NH4+. （1）
图5（a）为最优实验条件下此生物传感器对不同物质的量浓度尿素的光电响应.可以看到随着尿素物质的量浓度的增加，光电流逐渐升高.图5（b）是尿素物质的量浓度（c）与光电流强度变化（?I）的拟合图，可以发现两者在10-3～10-8 mol・mL-1范围内呈良好的线性关系，线性方程为?I=2 166+2 52lg c，相关系数的平方（R2）=0.981，最低检测限为1.8×10-9 mol・mL-1.
2.5 传感器重现性、稳定性和选择性考察
此外，还对传感器的重现性、稳定性和选择性进行了考察.图6（a）是不同批次制得的PANI/ITO和Urease/PANI/ITO电极的光电响应，发现不同批次之间光电流强度差异不大，表明该传感器重现性良好.另外，通过连续开/关灯约400 s，得到如图6（b）所示的光电响应结果，发现经过20多个循环之后，无论是PANI/ITO还是Urease/PANI/ITO电极，光电流仍然保持平稳状态，该生物传感器展现了优异的光稳定性.此外，对该传感器的特异性也进行了考察，选择了4种可能会对尿素测定带来干扰的物质，包括抗坏血酸（ascorbic acid）、肌酐、胱氨酸（cystamine）和葡萄糖（glucose），考察了传感器对它们的响应，结果如图6（c）所示，发现虽然这些干扰物的浓度高达0.01 mol・L-1，但它在电极表面的响应与背景接近，表明传感器选择性良好.脲酶对尿素特异性催化降解，保证了该传感器的特异性.
3 结 论
基于制备的Urease/PANI/ITO复合电极，利用PANI的半导体属性和可质子化特性，发展了可选择性检测尿素的PEC法.该传感器以脲酶为识别元件，利用脲酶可以特异性降解尿素产生NH4+导致PANI质子化，从而改变其导电状态，最终引起光电流的变化，建立尿素浓度和光电流强间的相关性，从而实现对尿素的快速、灵敏和特异性的检测.与其他方法比，该传感器成本低效益高，且具有操作简单的优势.
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（任编辑：郁慧，冯珍珍）
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