壮骨止痛胶囊抗实验性绝经后骨质疏松作用的三维组学分析
作者 :  李劲平 曾英 雷晓明 张国民 刘慧萍 莫新民

  [收稿日期] 2013-11-26   [基金项目] 国家自然科学基金面上项目(30873291,81273816)   [通信作者] *李劲平,副教授,硕士生导师,主要从事中药防治老年病研究,Tel:(0731)82650340,E-mail:pjingli@163.com
  [摘要] 该文提出了多维组学新概念,指出多维组学是研究中药复方药效物质基础与机制研究的恰当方法。以壮骨止痛胶囊抗实验性绝经后骨质疏松作用为例,从中药化学组学、基因转录组学、蛋白质组学等三维组学角度,较系统地阐明了壮骨止痛胶囊防治绝经后骨质疏松的药效物质与作用机制,同时,创造性地设计了一个三维表格直观地展现三维组学研究结果。该研究为中药复方药效物质和作用机制研究提供了一种新的思考方式和解决方案。
  [关键词] 多维组学;中药复方;物质基础;机制研究;壮骨止痛胶囊
  自然科学发展到20世纪末,随着人类基因组计划(HGP)的实施和完成,一种宏观的、系统的研究思维和研究方法涌现出来了,这就是各类组学(omics)技术。它们包括基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢物组学、细胞因子组学等,同时在中药化学与药效学研究中出现了中药化学组学新概念。各类组学技术的出现,对于加速疾病的病理机制和药物作用机制研究进程起了巨大推动作用。
  中药的药效物质和作用机制研究是中药现代化的重要研究内容,但是,由于中药固有的多成分、多靶点、多效应、多环节作用特点,使得中药药效物质和作用机制研究面临非常大的挑战。现在大多数学者从中药的某一成分或某一作用的角度进行研究,虽然也取得了一些成果,但离真正阐明中药药效物质和作用机制相距甚远。为探索一种新型的、适用于复方中药药效物质和作用机制研究的新思路,本课题组以多维组学(multidimensional omics)探讨壮骨止痛胶囊抗绝经后骨质疏松症的药效物质和作用机制,取得了预期的研究成果。
  1 多维组学的概念
  多维组学(multidimensional omics)是指综合应用多种组学方法,通过分析各类组学研究结果之间的内在关系,从多个维度阐明疾病或药物的作用机制。单个组学是一种小系统思维,而多维组学是一种大系统思维,多维组学比单个组学更适合于中药药效物质和作用机制研究。可用于中药作用机制研究的多维组学包括中药化学组学、基因转录组学、蛋白质组学和代谢物组学等。
  2 中药复方研究的基本科学问题
  多成分、多途径、多靶点、多效性是中药复方的作用特点,中药复方药理研究必需揭开2个黑箱才能真正阐明了中药的药理作用机制。
  第1个黑箱是中药复方的药效成分是什么?长期以来,进行中药复方药理研究时对这方面的研究报道非常少,而大量的文献报道集中在中药复方化学成分研究,而和复方药理几乎没有联系。没有阐明药效物质的中药药理不能成为完整意义上的药理研究。上述现象的出现可能与认识上的误区有关,重视中药对机体的病理生理过程的调节,而轻视产生这种调节作用的物质基础研究,同时也可能与研究者的知识背景有关系。目前存在2种解决方法:①先从中药中分离化学单体,再通过药效实验确认其药效,这种方法在前期分离化学单体方面存在非常大的盲目性;②从化学生物学出发,先筛选复方的有效部位群,然后用高效活性筛选方法筛到一些潜在药效成分,再通过药效实验确认其药效,这种方法的盲目性大大降低,针对性大大提高。通过学者们的努力,目前已初步建立了一些“中药化学组学”研究方法如活性导向分离方法[1]、高通量筛选方法[2]、血清药化学法[3]、肠内菌代谢法[4]、肠吸收法[5]、生物色谱法[6-7]、代谢物组学法[8]等。
  第2个黑箱是中药复方中含有众多的效应成分,那么,这些效应成分如何调节相关疾病的病理生理过程发挥疗效?中药复方药效成分的多成分是中药复方多途径、多靶点、多效性药理作用特点的物质基础。中药复方多成分、多途径、多靶点、多效性正好对应疾病的多环节、多靶点病理生理特点发挥作用。中药复方的这种作用特点正是中药复方治疗许多复杂疾病获得良效的奥妙所在,但同时也使研究其药理作用机制时遇到很大困难,面对众多的药理指标不知从何处着手研究。因此,必需寻找一种与中药复方作用特点相适应的研究方法,该类研究方法必需具有前瞻性和高通量等特点。基因转录组学、蛋白质组学和代谢物组学等组学则从系统的角度同时对大量基因、蛋白及代谢物进行检测,属于一种系统的解决方法,疾病或药效的任何变化都会在基因组、蛋白质组和代谢物组3个层面表现出来,这几种组学技术同时具有前瞻性和高通量性质,非常适合用于中药复方药理作用机制研究。
  综上所述,中药复方作用机制研究应包含两方面的研究,即中药复方的药效物质研究和中药复方药理作用机制研究。由于中药复方的复杂非线性作用特点,采用常规的一维研究方法在研究中遇到很大困难,而采用非线性的“多维组学”研究方法则相对容易。
  3 壮骨止痛胶囊抗绝经后骨质疏松作用的三维组学分析
  3.1 壮骨止痛胶囊治疗绝经后骨质疏松症的药效学基础 本课题组在古方补骨脂丸基础上结合多年临床用药经验研制成壮骨止痛胶囊,全方由补骨脂、淫羊藿、枸杞、骨碎补、牛膝等7味药物组成,功能补益肝肾、壮骨止痛。经过长期的临床应用证实其治疗绝经后骨质疏松症有良好的临床疗效,并已获得国家新药证书(国药证字[Z20050125])。经过一系列动物实验和临床实验表明,壮骨止痛胶囊能显著提高去卵巢模型大鼠的骨密度,逆转骨代谢的高转换状态[9],调节钙磷相关激素和细胞因子[10-11],改善骨的生物力学性能[12],延缓骨质疏松症的病理形态学改变[9,13],对治疗骨质疏松症有良好的疗效。虽然药效学实验充分阐明了壮骨止痛胶囊治疗绝经后骨质疏松症的药效作用,但不清楚壮骨止痛胶囊治疗骨质疏松症的深层次药理作用机制和药效物质基础。   3.2 壮骨止痛胶囊药效物质基础分析 从壮骨止痛胶囊的干浸膏开始,分别用极性由小到大的溶剂石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇、水依次进行提取,然后利用去卵巢骨质疏松模型大鼠筛选有效部位,结果表明其石油醚部位和无水乙醇部位为壮骨止痛胶囊的有效部位。然后,通过在体清醒大鼠肠襻吸收实验对无水乙醇部位进行活性成分筛选,通过HPLC比较给药后1,2,3 h不同时点胃肠道中的剩余药量,在HPLC图谱中产生差异的色谱峰即为潜在药效物质峰。再通过萃取、柱色谱分离等技术分离差异峰物质,经药效学筛选后将有效成分经过UV,IR,NMR,MS等鉴定结构。结果从无水乙醇部位分离得到淫羊藿苷、杯苋甾酮、柚皮苷、朝藿定B等有效成分[14-15]。由于石油醚部位物质的极性太小,很难得到分离度满意的HPLC图谱,因此,石油醚部位采用传统的分离方法进行了艰巨的分离工作,经药效学筛选后,最后得到补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定和齐墩果酸等有效成分[16]。至此,基本研究清楚了壮骨止痛胶囊治疗绝经后骨质疏松的中药化学组学基础。
  3.3 壮骨止痛胶囊抗绝经后骨质疏松的转录基因组学分析 在基本研究清楚了壮骨止痛胶囊抗绝经后骨质疏松的化学组学基础上,接着研究了全方、有效部位和部分有效成分抗绝经后骨质疏松的基因转录组学。结果表明,绝经后骨质疏松大鼠股骨有532个基因表达发生了变化,全方对于骨质疏松模型大鼠股骨的126个表达发生改变的基因均有不同程度的调节作用,这些基因中已知功能的有45个基因,其余81个基因的功能尚不清楚[17]。将这45个基因根据其功能分为细胞保护基因、能量代谢基因、无机离子代谢基因、信号传导基因、细胞结构基因、基因表达相关基因、免疫相关基因、脂代谢基因、细胞损伤修复基因、胞外基质代谢基因等10个功能类群(表1)。与无水乙醇部位比较,石油醚部位主要侧重于对能量代谢基因具有调节作用。与石油醚部位相比,无水乙醇部位主要侧重调节控制基因表达的基因、信号传导基因及胞外基质代谢基因。淫羊藿苷主要对细胞保护基因和能量代谢基因具有调节作用[18-19]。从转录基因组学分析表明随着化学组学的变化,转录组学随之发生相应的变化,并且,壮骨止痛胶囊各化学组对基因转录组的调节各有侧重。
  3.4 壮骨止痛胶囊抗绝经后骨质疏松的蛋白质组学分析 在研究转录基因组学的同时,课题组研究了壮骨止痛胶囊全方、有效部位和部分有效成分抗绝经后骨质疏松作用的蛋白质组学。结果表明,全方对于骨质疏松模型大鼠股骨的32个蛋白具有调节作用,通过质谱鉴定了其中的21个蛋白[20-21]。这些蛋白分别涉及骨细胞的细胞保护、能量代谢、细胞信号传导、免疫、无机离子代谢、细胞损伤修复、细胞凋亡、细胞迁移等8个方面功能。与无水乙醇部位相比,石油醚部位侧重于对能量代谢相关蛋白的调节。与石油醚部位比较,无水乙醇部位侧重于对细胞信号传导、细胞凋亡、细胞迁移等相关蛋白的调节。淫羊藿苷调节的蛋白涉及细胞保护、能量代谢、信号传导、细胞凋亡、细胞迁移等方面。蛋白质组学分析结果表明随着化学组学的变化,蛋白质组学也随之发生相应的变化,并且,壮骨止痛胶囊各化学组对蛋白质组学的调节各有侧重。
  3.5 壮骨止痛胶囊抗绝经后骨质疏松的三维组学综合分析 怎样在同一张表格中表现三维及三维以上的组学结果是一个值得探讨的问题,合理的表格设计可以直观地反映各组学研究结果之间的相互关系。本文设计了一种三维表格(表1),各维组学结果集中展现在表格的中间区,中药化学组学作为自变量安排在表格的横列,其他组学作为因变量安排在纵列,在每一个自变量下按一定顺序安排相应因变量,这样便于比较各组学随化学组学而变化的情况。
  通过对三维表的分析,发现如下特点:①壮骨止痛胶囊各化学组除了调节共同的基因和蛋白外,每个化学组对基因组和蛋白质组的调节均各有侧重。如石油醚部位侧重对能量代谢基因和蛋白的调节,无水乙醇部位侧重对信胞信号传导相关基因和蛋白的调节,淫羊藿苷侧重于对能量代谢相关基因和蛋白的调节。②转录基因组学研究结果与蛋白质组学研究结果在功能上具有显著相关,但是,除少数基因与蛋白一一对应外,绝大多数基因和蛋白并非存在一一对应的关系。由于基因组学和蛋白质组学2种组学的灵敏度不一致,以及从基因表达到蛋白翻译过程的影响因素太复杂,因此,出现基因组学结果不能与蛋白质组学结果一一对应的现象。另外,基因组学中有大量基因表达已发生变化,但其变化值尚未超过分析规定的阈值。但是,从功能区划来说,2种组学的研究结果是一致的,这也说明很有必要从多维组学角度进行中药物质基础和作用机制研究。③蛋白质组学显示了一些基因组学没有显示的功能变化,如与细胞迁移相关的Myosin light chain 3蛋白在基因组学中没有反映出变化,而细胞迁移与破骨细胞的溶骨活动和成骨细胞的成骨活动密切相关,这也更进一步表明从多维组学研究中药复方药理作用机制的必要性。
  从壮骨止痛胶囊抗绝经后骨质疏松作用的三维组学研究分析可见,对于中药复方的作用机制研究,不能仅仅从单一的复方和单一的组学进行研究,而应从复方、有效部位、有效成分等多层次化学组学,以及基因转录组学、蛋白质组学、代谢物组学等多层次生物组学出发进行研究,才能阐明化学组学与多个生物组学之间的内在变化规律。
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