CD4+CD25+Treg细胞的分选\表型鉴定及Foxp3表达鉴定

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　　【摘要】 目的 为验证从C57BL/6小鼠脾脏中分离出高纯度CD4+CD25+Treg细胞及证实CD4+CD25+Treg细胞中Foxp3基因的表达。方法 使用免疫磁珠分选出CD4+CD25+Treg细胞,流式细胞仪检测纯度;使用TRIZOL抽提Foxp3基因mRNA,使用RT-PCR方法逆转录出Foxp3基因的cDNA。结果 从C57BL/6小鼠脾脏中分离出了纯度达到90%CD4+CD25+Treg。进一步应用RT-PCR技术克隆出Foxp3的cDNA,通过凝胶电泳证实了克隆出了Foxp3的cDNA。结论 使用免疫磁珠方法能够分离出C57BL/6小鼠CD4+CD25+Treg细胞,并进行了Foxp3基因表达的鉴定。
　　【关键词】免疫磁珠;CD4+CD25+Treg细胞;Foxp3基因
　　
　　CD4+CD25+Treg cell separate,phenotype identity and Foxp3 gene expression identity
　　
　　HAN Wen-jie,SHI Yan-xia.Third Department of Oncology,The First People’s Hospital of Shangqiu City,Henan 476100, China
　　【Abstract】 Objective To confirm high purity CD4+CD25+Treg cells can be separated from the spleen of C57BL/6 mice and Foxp3 gene can be express in CD4+CD25+Treg cells.Methods CD4+CD25+Treg cells are separated with immunomagnetic beads,and purity is detected by flow cytometry.Foxp3 gene mRNA is extracted using TRIZOL.Foxp3 gene cDNA is reverse transcription using RT-PCR technology.Results This study separated CD4+CD25+Treg cell of 90%purity from the spleen of C57BL/6 mice,to advance used technology of RT-PCR to make the clone of Foxp3 gene cDNA,and confirmed it is the cDNA of foxp3.Conclusion This study CD4+CD25+Treg cell can be separated from the spleen of C57BL/6 mice with immunomagnetic beads,and identified foxp3 gene expression.
　　【Key words】
　　Immunomagnetic beads;CD4+CD25+Treg cells;Foxp3 gene
　　
　　肿瘤患者体内的免疫耐受是影响免疫治疗效果的重要原因,肿瘤免疫耐受的产生可能有两方面的原因:①肿瘤本身所产生的IL-10、TGF-β等免疫抑制性细胞因子;②机体自身的免疫抑制状态。免疫抑制性调节细胞是机体实现正常免疫耐受的关键,而这些免疫抑制性调节细胞在肿瘤患者体内的明显增多也是导致肿瘤免疫耐受的关键,其中,CD4+CD25+Treg细胞又被认为是目前所发现的最重要的免疫抑制性调节细胞。
　　1 材料及方法
　　1.1 材料 8周龄雌性C57BL/6小鼠由中山大学实验动物中心提供。小鼠CD4+CD25+Treg细胞磁珠分离试剂盒、小鼠CD4-FITC单抗、小鼠CD25-PE单克隆抗体均购自MiltenyiBiotec公司。HRP标记的羊抗小鼠IgG及小鼠mAbIg亚类检测试剂盒均购自Sigma公司。RPMI1640培养基购自Gibco公司。小牛血清购自Gibco公司。羊抗小鼠foxp3 mAb购自eBioscience公司。流式细胞仪为美国BECKMAN-COUTER公司产品。
　　1.2 分离小鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞 采用颈脱臼法处死C57BL/6小鼠,剪开腹腔,在无菌条件下取出小鼠脾脏。迅速在含有200 U/ml庆大霉素的生理盐水中冲洗2次。在200目滤网上磨碎脾脏,红细胞裂解液裂解红细胞,按照小鼠CD4+CD25+Treg细胞磁珠分离试剂盒说明书进行操作,通过流式细胞仪(BD FACS Calibur)分析获得的CD4+CD25+Treg细胞纯度。
　　1.3 Foxp3总RNA抽提 取1×106个细胞,根据试剂盒说明书进行操作提取总RNA,将总RNA反转录为cDNA。PCR总反应体系50 μl,循环参数:94℃30 min 预变性,94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,共30个循环,最后以72℃延伸10 min。
　　2 结果
　　2.1 CD4+CD25+T细胞分选结果 流式结果显示分离出CD4+细胞纯度达到94.18%;CD4+CD25+Treg细胞纯度达到90%(见图1)。
　　2.2 Foxp3总RNA抽提及RT-PCR进行总cDNA构建 结果显示本试验提取出了小鼠CD4+CD25+Treg细胞的总RNA(见表1),并成功应用RT-PCR进行了总cDNA构建(见图2、图3)。
　　表1
　　
　　RNA抽提核酸蛋白分析仪检测总RNA浓度表
　　样品名称OD260/OD280总体积(μl)终浓度(μg/μl)总量(μg)
　　SYX-RNA1.9100.5 μg/μl5
　　电泳图2结果显示总RNA样品质量良好,无明显降解现象。
　　电泳图3显示了RT-PCR检测到Foxp3可以表达。电泳图谱中有目标条带,PCR片段长度:1356 bp。
　　3 讨论
　　1995年Sakaguchi[1]等首次报道了一种新型的免疫抑制细胞CD4+CD25+Treg[2],其表型特征为持续性表达CD25+和CTLA-4、GITR等表面分子。2004年Bueder等[3]发现Treg细胞(regulate T cells)表面组成性表达Neuropilin21(Nrp21)特征性标志,具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特征。CD4+CD25+Treg在多种肿瘤如黑色素瘤、非小细胞肺癌、食道癌、胃癌、何杰金病等的肿瘤浸润淋巴细胞和外周血中比例均明显增高[4]。Foxp3(forkhead/winged-helix P3)是一种转录抑制因子,是forkhead/winged-helix 家族成员[5]。到目前为止,已经定义了15类Fox蛋白[6]。表达Foxp3的T细胞均具有免疫抑制作用,推测Foxp3的表达可能是导致这些细胞发挥其作用的主要原因[7]。Fontenot[8]等发现,高表达Foxp3的转基因小鼠CD4+CD25+Treg细胞数量明显增加;Foxp3敲除小鼠却缺乏独立的CD4+CD25+Treg细胞。Fehervari[9]等将从正常小鼠分离的Treg细胞注入 Foxp3缺陷小鼠体内,结果发现能阻止这种小鼠自身免疫疾病的发生。Walker[10]等通过转基因技术人为地使CD4+CD25+Treg细胞表达Foxp3,发现这些转染后的细胞获得了Treg细胞表型和功能。

　　研究认为IL-2是CD4+CD25+Treg发育和增殖的关键因子以及维持CD4+CD25+Treg细胞抑制性和反应性的关键因素[11]。Foxp3是CD4+CD25+Treg细胞特异性的核转录因子,也是CD4+CD25-Treg细胞转变成CD4+CD25+Treg细胞的标志[8,12]。同时IL-2在维持CD4+CD25+Treg的Foxp3基因表达稳定和细胞的新陈代谢方面发挥了关键的作用[8]。
　　本实验使用免疫磁珠技术,从C57BL/6小鼠脾脏中分离出了CD4+CD25+Treg纯度高达90%;本实验也证实了CD4+CD25+Treg细胞约占外周CD4+T细胞的5%~10%,从107~2×107个小鼠脾脏CD4+T细胞中仅能够分选出106~1.2×106个CD4+CD25+Treg细胞这与以前的研究结果相符合[13]。本实验还发现分选从分离出的细胞中抽提出Foxp3的RNA,使用RT-PCR技术反转录出了Foxp3基因的cDNA凝胶电泳证实了是Foxp3基因cDNA。长度为1536 bp,测序发现其序列与Genebank上的Foxp3(054 039)序列具有同源性,证实了CD4+CD25+Treg中确实存在foxp3基因表达。与HoriS[14]等报道结果一致。本实验还发现分选出的CD4+CD25+Treg细胞在含有20 U/mlIL-2的1640培养液(含10%FBS)中可以维持其活性,但是细胞不发生增殖,增加IL-2达到1500 U/ml时细胞仍不增殖,这种原因仍不清楚,Shevach EM.[15]认为CD4+CD25+Treg细胞作为一种Treg细胞,在体外不具有自我扩增增殖的能力,只有在高剂量的IL-2和CD3+、CD28+持续刺激的情况下才具有有限扩增增殖的能力。本实验认为本研究中CD4+CD25+Treg细胞不发生增殖的原因有待于进一步研究。
　　本研究使用免疫磁珠方法分离出C57BL/6小鼠CD4+CD25+Treg细胞,并进行了Foxp3基因表达的鉴定,为进行CD4+CD25+Treg细胞和Foxp3基因功能检测提供了方法学上的可能。
　　图1 CD4+CD25+Treg细胞流式细胞仪检测图
　　A 阴性对照;B CD4+T细胞图;C CD4+CD25+Treg细胞图;B结果显示CD4+T细胞占细胞数量的98%;C结果显示CD4+CD25+Treg细胞占细胞总量的90%
　　图2 Total RNA 电泳结果
　　从左至右1.marker,2.0.5 μg总RNA上样,3.1 μg总RNA上样
　　图3 RT-PCR结果从左至右1.Marker,2.RT-PCR产物
　　
　　参考文献
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