基于纳米压痕测试的骨骼力学特性解剖学区域差异研究
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作者:张冠军 顾红跃 陈萍 李振涛 贾晓航
摘要：厘清骨骼不同解剖学区域的力学性能差异可为构建高生物逼真度的骨骼有限元模型提供重要依据.从牛股骨中段的前、后、内、外四个解剖学区域各制备一个试样，采用玻式压头对每个试样分别进行18个点的纳米压痕试验，记录加载力和压入深度的时间历程曲线，获得各压痕点的压入模量和硬度.结果显示长骨前侧、后侧、外侧、内侧的压入模量分别为20.78±2.66GPa、18.66±2.57GPa、16.39±2.29GPa、21.57±2.19GPa，硬度分别为0.65±0.79GPa、0.58±0.08GPa、0.44±0.06GPa、0.61±0.15GPa.方差分析表明，解剖学区域对压入模量和硬度的影响显著（p<0.001）;组间多重比较表明，前侧试样的压入模量和硬度显著高于外侧试样，内侧试样的压入模量和硬度显著高于外侧试样，后侧试样的硬度显著高于外侧试样，内侧试样的压入模量显著高于外侧试样.因此，采用非均一材料将有助于提升长骨有限元模型的生物逼真度.
关键词：纳米压痕测试;力学特性;骨骼;喝肽Ａ;解剖学区域
中图分类号：U461.91
文献标志码：A
收稿日期：2021-02-26
基金项目：国家自然科学基金创新研究群体项目（51621004），湖南省自然科学基金项目（2019JJ40034），
作者简介：张冠军（1981-），男，山东济宁人，湖南大学副教授，博士
?通信联系人，E-mail：zgjhuda@163.com
骨骼是一种具有层次结构的复合材料，对其力学性能的研究一直广受关注.皮质骨主要由矿物质
（50%-60%）、胶原蛋白（30%-40%）和水（10%-20%）组成，矿物质比较坚硬，而胶原蛋白比较松软，二者的相互作用决定了骨骼的微观力学性能[1].皮质骨的力学性能不仅仅取决于其组成成分，也受微观结构的影响[2].皮质骨的微观结构主要有环骨板、骨单位以及间质骨，大型哺乳动物在生长发育过程还会形成层状骨[3].由于这几种结构在骨骼的分布不均匀，骨骼不同区域的力学性能也不相同.准确地获取皮质骨的微观力学性能不仅对理解骨骼的整体力学性能至关重要，而且对建立更加精细的有限元模型以模拟骨骼裂纹损伤也起着相当关键的作用.
目前，很多学者探究了骨骼不同解剖学区域的力学性能.Bonney等[4]采用三点弯曲试验探究了猪股骨不同解剖学区域的力学性能与成分之间的变化趋势;Li等[5]采用三点弯曲试验探究了牛股骨不同解剖学区域的断裂韧性;Li等[6]采用压缩和拉伸试验方式分析了牛股骨不同解剖学区域的力学性能变化;Abdel-Wahab等[7]采用拉伸试验研究了骨骼不同解剖学区域以及不同方向的力学性能;Duchemin等[8]采用拉伸和压缩试验探究了骨骼不同解剖区域的密度与弹性模量之间的关系;Espinoza Orías等[9]采用超声波测试探究了骨骼的弹性各向异性和不均匀性在不同解剖学区域的变化规律;Malo等[10]采用声学显微镜探究了骨骼弹性系数在不同解剖学区域的变化.受限于传统试验方法对试样尺寸、形状等的要求，上述研究难以从微观层面分析解剖学区域对骨骼力学性能的影响.
微纳米压痕测试方法能够在微/纳米尺度上开展力学测试.Rasoulian等[11]采用参考点压痕技术（RPI）探究了骨骼不同解剖学区域力学性能与成分之间的关系.Bosiakov等[12]采用纳米压痕技术探究了骨骼不同象限的弹性性能和韧性.得益于纳米压痕技术的微观尺度，上述研究在微观层面上研究了骨骼不同解剖学区域的力学性能.由于骨骼试样的生物多样性，统计分析是研究骨骼解剖学区域力学差异的必要方法，但上述文献在这方面存在局限性.
针对目前研究存在的不足，本文以牛股骨皮质骨为研究对象，利用纳米压痕试验方法测试了骨骼不同解剖学区域的力学性能，采用统计方法分析了骨骼力学性能在不同解剖学区域的差异.
1试样制备与试验
1.1压痕试样制备
从本地的屠宰场获取一根新鲜的牛股骨，牛的年龄为18-24个月（成年）.首先使用手术刀等工具剔除肌肉组织，进行CT检查以排除病变等可能对力学性能有影响的骨骼缺陷.然后使用马克笔在股骨中段标记切割区域，使用手工锯按照标记从骨干中段获取一个厚度为30mm的骨环，如图1（a）所示.再用马克笔在骨环表面按照解剖学区域将骨环划分为前、后、内、外四个区域，使用手工锯将骨环分割成四个扇形块，如图1（b）所示.随后使用马克笔在扇形切片的中部画出长方体试样的横截面（10mm×5mm），使用手工锯切割得到4个10mm×5mm×30mm的长方体试样.最后用粗糙度为320的碳化硅砂纸（ASC，耕耘，中国）对试样表面进行打磨，最终尺寸为7mm×3mm×15mm，如图1（c）所示.在每个试样的六个面标记其方位（近心端P、远心端D）和解剖学区域（前侧A、后侧P、内侧M、外侧L）.整个切割和打磨过程不停地喷洒浓度为0.9%的生理盐水，以避免温度过高对骨骼力学性能产生影响.
为方便试样打磨以获得光滑的测试面，通常将骨骼试样镶嵌在某种基材中.有文献表明，环氧树脂具有高黏度和快速固化的特点，能够有效避免环氧树脂渗透到骨骼的孔隙中影响骨骼的纳米压痕试验结果[13].因此，本文选取环氧树脂作为镶嵌基材.镶嵌时，需要将环氧树脂和固化剂按比例混合并搅拌，待混合液清澈后浇注于放置了皮质骨的模具中，在室温下固化后进行脱模以获得环氧树脂包裹的纳米压痕试样，如图2所示.
对镶嵌好的试样进行打磨抛光以确保试样的被测试面达到纳米压痕测试的粗糙度要求.分别使用粗糙度为P600、P1200、P1500、P2500、P4000的碳化硅砂纸（ASC250A，耕耘，中国）依次对试样表面进行打磨，再使用3μm、1μm和0.25μm的抛光绒布
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