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PM2.5对肝细胞脂质代谢和氧化应激的影响

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  [摘要] 目的 探讨大气细颗粒物PM2.5对肝细胞脂质代谢和氧化应激的影响。 方法 收集2014年广州城区大气中的PM2.5,以CCK-8法分析6.25~100 μg/ml的PM2.5对肝L02细胞的毒性。根据PM2.5浓度分别设立6.25 μg/ml组、12.50 μg/ml组和25.00 μg/ml组,同时设立阴性对照组,比较各组细胞内三酰甘油和胆固醇含量、肝X受体α(LXRα)和固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)的表达水平及氧自由基水平。 结果 PM2.5浓度为50.00 μg/ml时,对肝L02细胞有明显毒性。各剂量组肝细胞内的三酰甘油浓度显著高于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。25.00 μg/ml组的LXRα和SREBP-1c表达水平显著高于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。各剂量组的氧自由基水平显著高于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。 结论 PM2.5可通过LXRα和SREBP-1c诱导肝细胞脂质堆积,并诱发肝细胞氧化应激,这可能是PM2.5引起非酒精性脂肪肝的重要机制。
  [关键词] PM2.5;肝细胞;脂质代谢;氧化应激
  [中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2016)03(c)-0009-03
  [Abstract] Objective To explore the influence of PM2.5 on lipid metabolism and oxidative stress of hepatocyte. Methods PM2.5 was collected from atmosphere in urban area of Guangzhou in 2014.Toxicity of liver L02 cell was analyzed by CCK-8 at PM2.5 levels of 6.25-100 μg/ml.The group of 6.25 μg/ml,12.5 μg/ml,25 μg/ml was set respectively,and the negative control group was set.The contents of intracellular triglyceride and cholesterol,the expression level of LXRα and SREBP-1c,the intracellular oxygen free radical level among four groups was compared. Results When the PM2.5 concentration was 50 g/ml,which had obvious toxicity to liver L02 cells.The concentration of triacylglycerol in the liver cells in each dose group was higher than that in the negative control group,with significant difference (P<0.05).The expression level of LXRα and SREBP-1c in the group of 25.00 g/ml was higher than that in the negative control group,with significant difference (P<0.01).The level of oxyradical in each dose group was higher than that in the negative control group,with significant difference (P<0.01). Conclusion PM2.5 can induce lipid accumulation in hepatocytes via LXRα and SREBP-1c,and induce oxidative stress in hepatocytes,which may be the important mechanism of PM2.5 causing non-alcoholic fatty liver disease.
  [Key words] PM2.5;Hepatocyte;Lipid metabolism;Oxidative stress
  非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指排除酒精及其他明确肝损伤因素之外造成的,以肝脏脂肪沉积和肝细胞脂肪变性为特征的临床病理综合征[1]。近年来的流行病学研究显示,PM2.5与NAFLD的发生、发展密切相关[2-3]。目前,关于PM2.5在NAFLD中的作用,尤其是PM2.5对肝细胞的影响并不清楚。本研究通过培养人肝细胞L02株,观察PM2.5对肝脏细胞脂肪含量和氧化应激的影响,从肝细胞脂质合成关键蛋白肝X受体α(liver X receptor α,LXRα)和固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein 1c,SREBP-1c)的表达变化探讨PM2.5引起肝细胞脂肪堆积的原因。
  1 材料与方法
  1.1 试剂与仪器
  CCK-8试剂盒(日本同仁公司),Trizol、PrimeScriptTM RT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(日本TaKaRa公司),DCFH-DA(美国Lifescience公司),三酰甘油和总胆固醇检测试剂盒(南京建成生物有限公司),酶标仪(美国Bio-Tek公司),定量PCR仪器(美国Bio-Rad公司)。参照本室所建立的方法于2014年在广州城区采集大气中的PM2.5,采用无血清DMEM培养基配制成一定浓度-80℃保存备用[4]。   1.2 指标与方法
  1.2.1 CCK-8法检测PM2.5对肝细胞的毒性 取对数生长期的L02细胞,加入96孔板中,以终浓度6.25、12.50、25.00、50.00和100.00 μg/ml的PM2.5对肝细胞染毒,另设阴性对照组,每组设6个复孔,36 h后按说明书步骤测定细胞吸光度,计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验组OD值/阴性对照组OD值)×100%。
  1.2.2 胞内脂质含量测定 根据CCK-8结果选取6.25、12.50和25.00 μg/ml三个浓度的PM2.5对L02细胞染毒,另设阴性对照组。36 h后收集细胞,PBS洗涤两次,取细胞裂解液,按说明书检测总胆固醇和三酰甘油的浓度。
  1.2.3 LXRα和SREBP-1c基因表达检测 同步骤1.2.2分组和染毒,提取总RNA,按说明书用定量PCR检测两者的表达。LXRα上游引物:5′-TCA GAG AGG AAG CCA GGA TG-3′,下游引物:ACG GAT CTC TGT GGG TTC TG;SREBP-1c;上游引物:5′-CGA CAT CGA AGA CAT GCT TCA G-3′,下游引物:5′-GGA AGG CTT CAA GAG AGG AGC-3′;β-actin上游引物:5′-TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A-3′,下游引物:5′-CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G-3′。PCR条件为95℃预变性30 s,然后95℃ 5 s、60℃ 30 s,共40个循环。目的基因的表达水平采用2-ΔΔCt法进行计算。
  1.2.4 胞内ROS水平检测 同步骤1.2.2分组和染毒,4 h后用PBS漂洗2次,按说明书步骤以DCFH-DA荧光染料(5μm)标记胞内的氧自由基,30 min后用酶标仪进行测定。
  1.3 统计学处理
  采用GraphPad Prism 5软件对数据进行分析,计量资料以x±s表示,采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 PM2.5对L02细胞的毒性分析
  PM2.5浓度为50.00 μg/ml时,对肝L02细胞有明显的毒性,细胞存活率为(80.44±6.42)%,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。当PM2.5浓度<25.00 μg/ml时,L02细胞生长虽然部分受到抑制,但与阴性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),因此,本研究选用6.25、12.50和25.00 μg/ml作为后继实验中PM2.5的终浓度。
  2.2 PM2.5对肝细胞胞内脂质含量的影响
  PM2.5处理后,肝细胞内三酰甘油浓度明显增高,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞内总胆固醇含量与阴性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)(表1),提示PM2.5使肝细胞内三酰甘油含量增高,进而诱导肝细胞脂肪变。
  2.3 PM2.5对LXRα、SREBP-1c表达的影响
  各剂量组的LXRα和SREBP-1c表达水平显著增高。25.00 μg/ml组的LXRα和SREBP-1c表达水平分别为阴性对照组的(1.29±016)倍和(1.89±0.21)倍,差异有统计学意义(P<0.01)(图1),提示PM2.5可以上调两者的表达,这可能是PM2.5引起肝细胞内三酰甘油含量增高的原因之一。
  2.4 PM2.5对L02细胞氧自由基生成的影响
  PM2.5刺激后,各剂量组肝L02细胞内有大量ROS形成,荧光强度分别是阴性对照组的(153.37±12.35)%、(134.05%±10.30)%和(143.83%±10.08)%,差异有统计学意义(P<0.01),提示PM2.5可以引起肝细胞的氧化应激,导致细胞内氧自由基生成增多。
  3 讨论
  近年来的流行病学研究显示,NAFLD在我国城市人口中的患病率已达到或超过某些西方国家的水平[5]。除严重影响肝脏功能外,NAFLD还与代谢综合征、动脉粥样硬化等重大疾病密切相关,因此,其被认为是一种危害全身健康的肝脏疾病[1]。“二次打击”学说是关于NAFLD发病的经典学说,认为脂类在肝细胞内的聚集是NAFLD发生中的第一次打击,在此基础上各种肝毒性物质刺激肝细胞和库普弗细胞活化,引起氧化应激,促使局部肝细胞发生炎性反应、脂质过氧化和细胞损伤,形成第二次打击,导致NAFLD的发生[6]。
  PM是大气中所有颗粒物的总称,其中影响人类健康的主要是空气动力学直径≤2.5 μm的细颗粒物PM2.5。研究显示,PM2.5可直接进入血液循环,影响全身多个组织器官的功能[7]。最近的流行病学调查显示,PM2.5与NAFLD的发病率呈正相关[8-9]。动物实验研究结果显示,PM2.5吸入可使小鼠肝脏组织出现脂肪变[10-11]。这些研究虽然证实了PM2.5与NAFLD关系密切,但并未对PM2.5影响NAFLD的机制进行探讨。本研究结果显示,PM2.5处理后肝细胞三酰甘油含量明显增高,提示PM2.5可以促进NAFLD发病机制中的第一次打击。LXRα和SREBP-1c是脂肪酸合成的关键性分子[12-13],本实验结果显示,PM2.5可使L02细胞LXRα和SREBP-1c表达明显增高,提示其可能是PM2.5引起肝细胞脂肪含量增多的机制之一。
  氧化应激是造成NAFLD第二次打击的主要原因[14]。NAFLD大鼠肝脏组织中的氧自由基水平远高于正常大鼠,给予抗氧化药物后则可明显改善NAFLD的病变程度,提示氧化应激在其中具有关键作用[15]。本实验结果显示,PM2.5染毒导致肝细胞生成大量的氧自由基,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),提示PM2.5还可通过影响NAFLD发生中的第二次打击来引起肝细胞损伤。   综上所述,PM2.5染毒导致肝细胞内脂质和氧自由基增多,这可能是其引起NAFLD的原因。此外,LXRα和SREBP-1c表达上调与PM2.5促进肝细胞脂质合成有关。
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  (收稿日期:2015-11-23 本文编辑:祁海文)
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