外源性bFGF对阿霉素渗漏局部皮肤损伤的保护作用

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　　[摘要] 目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）对阿霉素（盐酸多柔比星）药物渗漏兔模型局部皮肤组织损伤的保护作用。 方法 对成年新西兰大白兔54只注射阿霉素建立药物渗漏皮肤损伤模型后，分别在30 min、24 h、72 h三个区段对损伤区域实施bFGF外敷和硫酸镁外敷，并与不干预对照，比较干预后3 d、5 d、8 d、11 d、14 d、22 d等6个时间点的肉眼、光镜观察的局部皮肤组织损伤程度。多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。 结果 （1）肉眼观察结果：阿霉素外渗30 min干预后bFGF组的皮损评分显著低于硫酸镁组，差异有统计学意义（P<0.05），外渗24 h干预后，三组的皮损评分差异无统计学意义（P>0.05）；外渗72 h干预后，bFGF组的皮损评分显著低于硫酸镁组与对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。（2）病理观察结果：阿霉素外渗30 min干预后，bFGF组的病理损伤评分低于对照组，差异有统计学意义（P=0.049），外渗24 h及72 h干预后，bFGF组的病理损伤评分均显著低于硫酸镁组与对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。bFGF组和硫酸镁组外渗后24 h及72 h干预的病理损伤评分差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 bFGF对阿霉素药物渗漏损伤具有保护作用，其效果强于硫酸镁湿敷治疗。
　　[关键词] 碱性成纤维细胞生长因子；药物渗漏损伤；动物模型； 愈合修复
　　[中图分类号] R472 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）22-0027-04
　　Effect of exogenous bFGF on the prevention of local skin necrosis resulting from adriamycin extravasation
　　LIANG Shuxia1，2 HUANG Liquan2 DING Mingxing2 CHEN Guiyuan2 ZHU Louying3
　　1.Department of Operation Room， Jinhua Hospital of Zhejiang University， Jinhua 321000， China； 2.Medicine College of Jinhua College of Profession & Technology in Zhejiang Province， Jinhua 321007， China； 3.Center of Laboratory Animals of Jinhua City in Zhejiang Province， Jinhua 321000， China
　　[Abstract] Objective To investigate the protective effects of basic fibroblast fibroblast growth factor（bFGF） on local skin tissue injury caused by adriamycin（doxorubicin hydrochloride） extravasation in rabbit model. Methods The rabbit models of driamycin extravasation were established by injecting in 54 adult male New Zealand white rabbits. Totally， 54 rabbits were divided into three groups： bFGF group， magnesium group and control group. The three groups were respectively given bFGF， magnesium sulfate， and the non-intervention topilally at three segments 30 min， 24 h， 72 h after the successful establishment of the models. The degrees of local skin tissue damage after the intervention was evaluated by naked eye and light microscope at 6 time points（3 d， 5 d， 8 d， 11 d， 14 d， 22 d） were recorded and compared. Analysis of variance and LSD-t test were used for statistics. Results （1）Visual observation results： The lesion scores in the bFGF group were significantly lower than that in the magnesium group 30 min after driamycin extravasation（P<0.05）. The lesion scores between the three groups were not statistically significant 24 h after driamycin extravasation（P>0.05）. The lesion scores in the bFGF group were significantly lower than that in the magnesium group and the control group 72 h after driamycin extravasation（P<0.05）. （2） Pathological observations results： The pathological lesion scores in the bFGF group were lower than that in the control group 30 min after driamycin extravasation（P=0.049）. The pathological lesion scores in the bFGF group were significantly lower than that in the magnesium sulfate group and the control group 24 h and 72 h after driamycin extravasation（P<0.05）. The pathological lesion scores between 24 h and 72 h after driamycin extravasation were significant differences in the bFGF group and magnesium group （P<0.05）. Conclusion The bFGF has protective effects on the skin injury caused by adriamycin extravasation， and its therapeutic effect is better than magnesium sulfate. 　　[Key words] Basic fibroblast growthfactor（bFGF）； Chemotherapeutic extravasation injury； Animal model； Wound healing
　　化疗药物外渗引起的局部皮肤和组织损伤是较常见的副反应，临床表现为局部组织的炎症、溃疡，甚至坏死[1，2]。其中尤以蒽环类抗肿瘤药物及植物碱类抗肿瘤药物外渗造成的后果严重，如阿霉素等以静脉给药为主，外渗后临床多采用冷敷、封闭等处理，疗效欠佳，无公认有效措施[2，3]。而新近碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）已用于治疗伤口和溃疡，能促进伤口的无瘢痕复原[4，5]，但鲜见在化疗药物外渗损伤中应用。本研究通过复制阿霉素渗漏新西兰兔局部皮肤和组织损伤模型，观察bFCF对于局部皮肤组织损伤的保护作用。现报道如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料
　　健康新西兰同种家兔54只，体重2.5～3.0 kg，雌雄各半，由金华市实验动物中心提供，许可证号SYXK（浙）2010-0151。阿霉素（盐酸多柔比星，浙江海正药业股份有限公司，批号 120307），bFGF（贝复济，重组牛碱性成纤维细胞生长因子，珠海亿胜生物制药有限公司，6300IU，批号20130803）。硫酸镁粉（南昌白云制药有限公司，500 g/袋，批号20130701）。LeicaDM2000光学显微镜产自德国Leica公司；UCMOS9000KPA显微镜CCD成像系统产自杭州图谱光电科技有限公司。
　　1.2 建模方法
　　取兔双背双臀作为实验区域。实验前24小时用脱毛剂将家兔背部毛脱尽，制成一块8 cm×8 cm的无毛区，家兔双臀部脱毛备直径约8 cm的皮肤；背部以免的脊柱为中心，划分为左背部与右背部，臀部平分为左右两区，分别在各区域皮下注射阿霉素1 mL（0.8 mg/kg，约1.0 mg/mL，）制成皮丘约1 cm2的化疗药物渗漏损伤模型，每只制成5个区域选择3个典型区域进行干预并评价。模型评价方法：参照柳英等[6]方法评判成功建立化疗药物渗漏损伤模型，即各区域注射准确剂量后，局部皮肤隆起成皮丘，直径约为2.0～2.5 cm。
　　1.3 干预与分组
　　54只新西兰同种家兔根据首次给药时间的不同分为化疗药物外渗后30 min、24 h和72 h组，每组18只。各组又按照干预方法不同分为bFGF外敷组、硫酸镁外敷组及不干预对照组，每组18只。在上述3个时间点，分别用含bFGF药液和50%硫酸镁溶液的1.5 cm×1.5 cm 无菌湿纱布两层（使用时用无菌蒸馏水稀释）覆盖于外渗局部，同样敷部范围超出渗漏区域0.5 cm，每日3次（bFGF总用量为200 IU/cm2），每次约15 min（一旦纱布变干马上更换），连续7 d。每组分别于各自首次干预后的第3 d、5 d、8 d、11 d、14 d、22 d共6个时间点，在腹腔麻醉下提取活体标本。
　　1.4 指标观察与方法
　　肉眼观察：各组外渗性损伤程度、面积及外渗性损伤愈合时间。皮肤损伤评分参照杨翠芹等[7]的方法，结合本实验特点，赋分为：皮肤正常为0分；红肿直径≤3 cm为1分；>3 cm为2分；溃疡直径≤1 cm为3分；>1 cm为4分。
　　组织病理形态学光镜观察：标本取材后用4%多聚甲醛固定3 d，制成石蜡包埋切片，连续切片行HE染色，在光镜下观察表皮是否完整、有无溃疡形成、坏死及炎细胞、成纤维细胞、新生血管等肉芽组织的增生情况。病理损伤评价参照郭鹏等[8]的方法：轻度损伤：弥散性炎性细胞浸润、表皮完好；中度损伤：组织水肿、散在出血、明显炎性细胞浸润；重度损伤：溃疡、组织坏死、出血。结合实际加入超重度损伤：组织结构完全消失，广泛坏死。计分方法为：轻度1分，中度2分，重度3分，超重度4分。
　　1.5 统计学方法
　　采用SPSS17.0统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用重复测量方差分析，两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 阿霉素不同处理组局部组织损伤程度肉眼观察比较
　　新西兰同种家兔在阿霉素注射后局部均出现界限不清的红肿、红斑颜色渐加深。1周内出现皮肤糜烂、溃疡，2周后渐愈合、结痂、瘢痕形成。在建模成功后30 min、24 h、72 h三个区段对损伤区域实施bFGF与硫酸镁外敷干预14 d后，肉眼观察显示两组皮损的愈合情况均较对照组良好，且bFGF组的愈合效果优于硫酸镁组，尤其在72 h干预更明显（封三图1）。
　　各组皮肤肉眼损伤评分比较见表1，在阿霉素外渗后30 min 和72 h干预后不同处理组的肉眼损伤评分差异有统计学意义（P<0.01）；LSD组间比较显示，外渗后30 min干预后bFGF组的皮损评分显著低于硫酸镁组，差异有统计学意义（P=0.00<0.05），外渗后24 h干预后bFGF组与硫酸镁组及对照组的皮损评分比较差异均无统计学意义（P=0.35、0.19，P>0.05）；外渗后72 h干预后bFGF组的皮损评分显著低于硫酸镁组与对照组，差异有统计学意义（P=0.00、0.01，P<0.05）。而外渗后30 min干预后硫酸镁组的皮损评分高于对照组，差异有统计学意义（P=0.00，P<0.05）。外渗后24 h和72 h干预后硫酸镁组与对照组的皮损评分差异无统计学意义（P=0.69、0.63，P>0.05）。同时，各组外渗后30 min、24 h及72 h干预的皮损评分差异均无统计学意义（P>0.05）；LSD组间比较显示，仅硫酸镁组外渗后30 min与24 h干预的皮损评分差异有统计学意义（P=0.047），见表1。 　　表1 阿霉素不同处理组局部组织损伤程度肉眼观察比较（x±s，分）
　　注：与硫酸镁组比较，*P<0.05；与对照组比较，▲P<0.05
　　2.2 阿霉素所致皮损在不同时间干预的病理观察比较
　　阿霉素注射后兔局部损伤3 d，光镜下均见表皮部分脱落，形成溃疡，深及肌肉组织，炎细胞浸润，部分坏死。阿霉素30 min、24 h、72 h干预后皮肤组织损伤达高峰时间分别为8 d、5 d、3 d；30 min、24 h、72 h三个区段对损伤区域实施bFGF与硫酸镁外敷干预14 d后，72 h干预时bFGF组在14 d炎症减轻，基本恢复正常，而硫酸镁组炎症尚明显；72 h干预时，bFGF组在22 d时炎症细胞浸润明显减轻，呈轻度损伤，而硫酸镁组炎症尚明显（封三图2）。
　　各组皮肤病理损伤评分比较见表2，在阿霉素外渗后24 h和72 h两个时间点干预后不同处理组的病理损伤评分差异均有统计学意义（P均<0.01）；LSD组间比较显示，外渗后30 min干预后bFGF组的病理损伤评分低于对照组，差异有统计学意义（P=0.049），外渗后24 h干预后bFGF组的病理损伤评分显著低于硫酸镁组与对照组，差异有统计学意义（P=0.00、0.00，P<0.05）；外渗后72 h干预后bFGF组的病理损伤评分显著低于硫酸镁组与对照组，差异有统计学意义（P=0.00、0.00，P<0.05）。而外渗后三个时间点干预后硫酸镁组与对照组的病理损伤评分差异则无统计学意义（P=0.32、0.06、0.51，P>0.05）。同时，bFGF组和硫酸镁组外渗后24 h及72 h干预的病理损伤评分差异均有统计学意义（P<0.05）；LSD组间两两比较显示，分别与30 min干预比较，bFGF组外渗后24 h、72 h干预的病理损伤评分的差异均有统计学意义（P=0.00、0.00，P<0.05），而硫酸组仅外渗后30 min与72 h干预间的病理损伤评分差异有统计学意义（P=0.01，P<0.05），见表2。
　　表2 阿霉素所致皮损在不同时间干预病理结果比较（x±s，分）
　　注：与硫酸镁组比较，*P<0.05；与对照组比较，▲P<0.05；与同组外渗后30 min干预比较，#P<0.05
　　3 讨论
　　本研究结果显示，bFGF外敷对阿霉素外渗致局部皮肤组织损伤具有保护作用，尤以化疗药物外渗后早期干预（30 min、24 h）效果优于硫酸镁外敷，显著强于未干预对照组。同时，bFGF及硫酸镁外敷对阿霉素外渗后延迟处理时（外渗后72 h干预时）出现的皮肤组织损伤的保护作用均明显，提示bFGF加速修复的进程，缩短治愈时间。
　　阿霉素是抗有丝分裂的细胞毒性药物，能成功地诱导多种恶性肿瘤的缓解而广泛用于临床，以静脉给药为主要途径，一旦药物渗漏出血管外，引起组织损伤与氢氧自由基的形成有关，通过损伤细胞膜脂质和DNA，产生局部组织坏死，溃疡可深及肌腱和关节，造成功能丧失[3]。国内化疗药物外渗引起损伤的发生率为0.1%～6.0%，国外达5.0%[9，10]，特别是长期多疗程化疗，患者静脉损伤严重，静脉穿刺困难，更易发生渗漏，不但增加患者的痛苦、加重经济负担与思想压力，若不及时、彻底地处理，有可能导致皮肤癌的发生[11]。目前关于化疗药物渗漏的防护对策方面，预防最为关键，其举措包括提高医护人员的防护意识及操作技术，正确选择静脉通道、遵守操作规程、规范输液方式及加强患者的健康宣教等[12]；而发生后处理主要采用局部封闭法、热敷或冰敷、各种药物软膏（包括中药外敷）外涂、注射特异性解毒剂等治疗方法[13，14]。而我们采用的bFGF为临床常用的生长因子之一，能激活内源性生长因子活性或上调生长因子受体表达，通过对ERK/Akt信号的磷酸化过程而加速成纤维细胞增殖和DNA合成，并提高TGF-β的分泌， 进而协同其他生长因子如VEGF对肌成纤维细胞形成发挥作用， 从而明显促进修复作用[15]。国外在皮肤组织工程伤口愈合中应用bFGF显示其快速愈合和减少换药等临床优势[16]，而 bFGF已在国内临床软骨工程方面广泛应用，并在牙洁治术中发现其能促进创伤牙龈组织生长和创面愈合[17]，均支持本研究结论。
　　本研究还发现，bFGF外敷对阿霉素外渗致局部皮肤组织损伤早期干预的保护作用最佳，分析原因可能是创伤早期局部受创组织中内源性bFGF的含量处于缺乏状态，到创伤后第2～4周其血清水平达到分泌高峰[18，19]，需用外源性的bFGF促进并刺激组织分泌bFGF，从而达到治疗作用。我们的结果提示，临床药物外渗早期使用bFGF可以预防溃疡发生，如能在30 min内干预，效果最理想，可将皮肤不良反应降至最低限度，以提高患者的生存质量，减少医疗纠纷。但本实验研究中效果评价采用肉眼损伤评分与病理评分结果略有不一，即肉眼损伤评分仅外渗后72 h干预后bFGF组的皮损评分明显低于对照组，疗效显著，而病理评分显示外渗后24 h干预及72 h干预后bFGF组的病理评分均低于对照组，疗效均显著，说明肉眼损伤评分阳性率低，而病理评分更准确，证实bFGF能抗炎、促进肉芽组织形成及修复愈合[20，21]。同时，本研究成功建立外渗后损伤的兔动物模型，制作简便，能充分模拟人类化疗药物外渗导致的皮肤组织损伤，具有可行性和可重复性，尤其在外渗后皮肤损伤的延迟反应研究中可能比相应的大鼠模型更具优势。
　　综上所述，bFGF外敷对阿霉素药物渗漏损伤具有保护作用，其效果强于硫酸镁湿敷治疗，其配制简便，值得临床推广。本动物实验的成功为临床治疗化疗药物渗漏损伤提供有力的实验依据，其作用机制及防控有待进一步研究。
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　　（收稿日期：2015-05-19）
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