流式细胞术的医学应用现状与前景

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　　[摘要]流式细胞术（FCM）是一种基于单颗粒的高通量、高内涵检测的技术，被广泛应用于生命科学和临床诊断，诞生至今已有52年的历史。近年来，流式细胞仪在液路、光路和信号转化、数据采集、计算等方面发展迅速，为个性化医疗背景下的血液学、免疫学、肿瘤学等提供单细胞水平更快、更精、更广的组学信息。目前我国FCM应用领域主要集中在免疫学、血液学、临床肿瘤学和造血干细胞移植应用等领域，本文总结了FCM的医学应用现状与前景。
　　[关键词]流式细胞术;个性化医疗;医学应用现状;前景
　　[中图分类号] R733.71          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）12（a）-0028-03
　　Current status and prospects of medical application of flow cytometry
　　ZHANG Yue-xia1   ZHANG Li-ying1   ZHAO Quan2
　　1. Department of Clinical Laboratory， Navy Qingdao Special Service Center， Shandong Province， Qingdao   266071， China; 2. Department of Clinical Laboratory， Navy Qingdao 971 Hospital， Shandong Province， Qingdao   266071， China
　　[Abstract] Flow cytometry （FCM） is a high throughput and intensive detection technique based on single particle， which has been widely used in life science and clinical diagnosis for 52 years. In recent years， flow cytometer has developed rapidly in liquid， light and signal transformation， data acquisition， calculation， etc. In the context of personalized medical treatment， it provides faster， more precise and broader histological information for hematology， immunology， oncology， etc. At present， the application of FCM in China mainly focuses on immunology， hematology， clinical oncology and hematopoietic stem cell transplantation. This paper summarizes the current status and prospects of medical application of FCM.
　　[Key words] Flow cytometry; Personalized medical treatment; Medical application status; Prospects
　　流式細胞术（flow cytometry，FCM）是一种生物技术，根据生物技术学科（例如计算机、流体力学和电子学），通过检测标记的荧光信号来检测悬浮液中的单细胞或其他生物颗粒，其能够在应用中具体分析细胞，包括细胞功能，特性等，是一种实现高速、一对一的细胞定量和分选技术[1-2]。FCM目前被广泛应用在免疫学、血液学、病理学、药理学、肿瘤学、细胞生物学、分子生物学等学科领域。
　　目前，中国的FCM应用领域主要集中在以下几个方面，①免疫学领域：FCM被用于评估人体的免疫功能状况，可以被辅助诊断诸如获得性免疫缺陷综合征（AIDS）等免疫系统疾病。②血液学领域：FCM被用来对血液系统疾病的免疫分型和对白血病最小残留病变（MRD）进行有效监测，通常被用来进行血液系统疾病的诊断、治疗评估和可能的复发监测。FCM的细胞免疫表型鉴定在诊断造血系统疾病时具有重大的意义，是最重要的国际公认标准之一，目前已被广泛接受并被认为是一种免疫表型鉴定方法。③临床肿瘤学领域：FCM可以了解DNA倍性和进行细胞周期分析，DNA异常倍性的出现意味着DNA合成异常或者合成障碍，这可能是肿瘤或癌前病变的重要标志之一。④造血干细胞移植领域：在器官移植领域，足够数量的造血干细胞对成功进行造血干细胞移植非常重要，同时FCM还具有鉴定和计数造血的功能[3]。
　　1 FCM及流式细胞仪
　　1.1 FCM
　　是用流式细胞仪测量液相中悬浮细胞或微粒的一种现代分析技术，它是众多不同学术背景、不同科技领域相结合的高科技结晶。FCM的主要方法是利用对流细胞术在悬浮细胞中的应用，根据生物技术学科（例如计算机、流体力学和电子学）中的应用知识进行测量，并对细胞进行特定分析，包括细胞功能和特性。近年来，随着FCM的发展和进步，它在医学检测领域的应用已逐渐得到扩展，包括细胞生物测定、免疫功能分析、临床肿瘤检测、病理学分析、血液检测等[4-5]。
　　1.2流式细胞仪
　　流式细胞仪的主要组成部分是：①流动室和液流系统;②激光源和光学检测系统;③光电管和检测系统;④信号处理系统和信号分析系统;⑤细胞进行分类和筛选系统。 　　流式细胞仪的基本工作原理是：先通过激光测量鞘液中的染色细胞标志物，然后记录荧光强度、荧光宽度及散射光强度等参数。此外，根据荧光标记的被检测物质的单克隆抗体的类型不同，对细胞成分进行分析。
　　2 FCM的医学应用现状
　　2.1 FCM在核酸检测中的应用
　　利用核酸染料观察核型和细胞分裂是流式技术的最早应用之一。FCM通过检测插入DNA双螺旋结构碱基对的核酸荧光染料被激发后的荧光强度得以实现。通过分支DNA杂交探针技术检测单细胞水平特异性mRNA，可以为研究和诊断提供准确可追溯的细胞信息[6-7]，从而了解病变情况。
　　2.2 FCM在液相活检中的应用
　　BEAMing技术结合了数字PCR以及流式技术，其方法是每一类DNA分子都会专一的与磁性珠相连接，然后DNA分子之间的差异可以通过流式细胞仪检测荧光标记来做出评估。这种方法是基于小珠（bead）、乳浊液（emulsion）、扩增（amplification）、磁性（magnetic）这四个主要组分来构建的，所以被称作为BEAMing。在液体活检中进行FCM，为低丰度基因如肿瘤来源的表皮生长因子受体（EGFR）、KRAS等基因以及Septin9基因甲基化的绝对定量检测提供了帮助，BEAMing技术正为针对癌症患者的靶向筛查、耐药性监测提供非侵入性的检测保障[8-9]。
　　2.3成像流式细胞仪
　　成像流式细胞仪整合了FCM和荧光显微镜成像技术，基于单细胞图像，获得有关细胞形态、细胞结构和亚细胞空间定位以及信号强度定量的完整信息[10-11]。既能提供细胞群的统计数据，又可以获得单个细胞的图像，从而提供了细胞形态学、细胞结构和亚细胞信号分布更直观、准确的细胞水平完整信息。
　　2.4微流式细胞术
　　微流式细胞术是芯片实验室的典范，具有便携式、价格便宜、易于操作等特点，可以滿足军事和疫区的快速检测需求。而且，通过结合磁性微球可以分离并计数细胞。乳化液滴PCR和荧光标记的Taqman探针用于扩增观察对象的基因，以实现分选。细胞变形能力、拉曼全光谱和其他平台用于细胞分选和准确分析[12-13]。
　　2.5体内流式细胞仪
　　体内流式细胞仪使用可穿戴设备通过光声、光热、拉曼光谱、高速透射电子显微镜、多光子共聚焦成像等方法获得异常的血管内细胞，或用于非侵入性动态观察分析的稀有细胞[14-15]。
　　2.6光谱流式细胞仪
　　光谱流式细胞仪的光路使用光栅代替二向色镜或全光谱棱镜。使用更灵敏的接收器[例如电荷耦合器件（CCD）]来代替传统的光电倍增管（PMT）接收器。光谱流式细胞仪可以识别每个光谱信号的独特形状，而不是传统的发射峰，终光谱信号可以通过计算机进行解析判断。表面增强拉曼散射（SERS）是光谱FCM的特定应用之一[16-17]。
　　2.7质谱流式细胞仪
　　质谱流式细胞仪是一种使用质谱仪对单细胞进行多参数检测的流动技术。它不仅继承了传统FCM高速分析的特点，并且具有高分辨率的质谱分析能力。这是FCM的新发展方向。它是近年来出现的一种单细胞分析技术。首先用背景极低的金属标记物标记样品，单细胞水平观察是通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）和FCM进行[18-19]。通过可视化和大数据计算，质谱流式细胞仪的数据在免疫表型、细胞内信号网络分析和细胞亚群进化等方面具有无与伦比的优势。
　　2.8 FCM在白血病诊断和治疗监测中的应用
　　白血病属于一种血液系统疾病。在各种急性白血病的诊断和鉴定中，一般形态学检查难以有效区分不同类型的白血病，现今的FCM在白血病的诊断和治疗监测中起着关键作用。就白血病免疫表型而言，目前通常使用FCM CD45/SSC两参数散射网设计方法进行分型鉴定。这种方法可以清楚地将骨髓造血细胞分为粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、未成熟细胞和有核红细胞群体，FCM能有效排除正常细胞对白血病免疫分型的干扰[20-22]。
　　2.9 FCM在肿瘤标志物检测中的应用
　　FCM通过检测细胞中DNA含量的变化来检测实体瘤。因此，FCM技术一直被认为是病理形态学诊断中肿瘤诊断的重要方面。①FCM可以通过对肿瘤细胞的DNA倍体进行分类，来鉴定肿瘤细胞的生物学特性;②FCM可以通过分析肿瘤细胞的细胞周期、增殖活性、凋亡水平和细胞分化，探索肿瘤细胞动力学的特征;③FCM可以对癌基因（ras基因家族、p21、bcl-2、cerbB-2、myc基因家族），抑癌基因（p53、RB、p16等），与转移相关的基因（CD44S、CD44V5、CD44V6、Nm23等），凋亡相关基因（caspases-3，膜联蛋白V、Survivin、CD95和肿瘤相关抗原细胞角蛋白）进行检测和分析，可以用于研究肿瘤细胞的基因表达特征，从而为肿瘤的治疗提供参数;④FCM可以对肿瘤患者的淋巴细胞及其亚群、巨噬细胞和细胞因子等进行检测和分析，从而可以探索肿瘤患者的免疫特征。
　　综上所述，通过FCM检测和分析肿瘤及相关细胞的各种参数，可以进一步提高肿瘤诊断研究水平[23-25]。
　　3 FCM的前景与思考
　　FCM在国外已有十多年的历史，在中国的应用发展时间还很短，仍然存在很多不足。从FCM的诞生开始，FCM的应用几乎涵盖了整个生命科学和医学领域，应用越来越广泛，尤其是越来越多地应用于临床诊断领域[26-30]。流式细胞仪是高端精密仪器，要求使用者掌握和具备免疫学、血液学、分子生物学等多学科的知识和技术，且仪器价格昂贵，这些因素阻碍了FCM在国内的应用和普及。另外，国内FCM设备和试剂主要依靠进口，导致我国FCM的临床应用相对缓慢。然而，近年来，国内流式行业已经推出了民族品牌并获得了临床认可。FCM与大数据和个性化医疗的需求高度兼容，必将为人类健康提供更准确的服务。 　　綜上所述，我国的FCM在临床和科学研究中得到了广泛的应用，并且在仪器仪表和技术上取得了一些进展，但也应该明确认识到，FCM的技术发展和临床应用仍需改进。
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　　（收稿日期：2019-04-15  本文编辑：孟庆卿）
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