补益营卫方对衰老皮肤表皮角蛋白18的影响

来源:用户上传      作者:王浩 周小平

　　摘要：目的 观察补益营卫方对衰老小鼠表皮角蛋白（Keratin，K）18的影响，探讨补益营卫方延缓皮肤衰老的机制。方法 传代培养年轻小鼠与自然衰老小鼠表皮细胞，将衰老小鼠表皮细胞分为2组，一组常规培养，一组用含2.5%补益营卫方培养基培养。采用蛋白免疫印迹法（Western blot）及实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）分别检测细胞K18蛋白、mRNA表达水平。结果 与年轻组比较，老年组K18蛋白与mRNA表达水平显著升高（P<0.05）;经2.5%药物干预后衰老表皮细胞中K18蛋白与mRNA表达水平较老年组降低（P<0.05）。结论 补益营卫方通过抑制衰老皮肤表皮K18蛋白及mRNA表达而延缓皮肤衰老。
　　 关键词：营卫;皮肤衰老;角蛋白18;中医药
　　中图分类号：R285.5   文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2020）02-0017-04
　　
　　
　　【Abstract】Objective： To observe the effect of Buyiyingwei Prescription on epidermal keratin 18 （K18） in aging mice and to explore the mechanism of Buyiyingwei Prescription to delay skin aging. Methods： The epidermal cells of young mice and natural aging mice were subcultured. The senescent mouse epidermal cells were divided into two groups. One group was routinely cultured and the other was cultured with 2.5% tonic Buyiyingwei Prescription medium. Western blot and real-time PCR were used to detect the K18 protein and mRNA expression levels of the cells respectively. Results： Compared with that of the young group， the expression levels of K18 protein and mRNA in the elderly group were significantly increased （P<0.05）. The expression levels of K18 protein and mRNA in the senescent epidermal cells were reduced after 2.5% drug intervention compared with that of the elderly group （P<0.05）. Conclusion： Buyiyingwei Prescription can delay skin aging by inhibiting the expression of K18 protein and mRNA in aging skin.
　　【Key words】 Yingwei， skin aging， keratin 18， traditional Chinese medicine
　　 我国正在发生深刻变化，人民的需求日益增长[1]。永葆青春，一直是人们追求。皮肤衰老，是人体最直观的衰老，严重影响了人的外在形象。中医理论认为营卫与皮肤及皮肤衰老有密切的关系。《内经》认为“五七，阳明脉衰，面始焦”，营卫化生于中焦脾胃，皮肤腠理是营卫交会的场所。随着年龄的增加，营卫生成来源不足，足阳明胃经气衰，脏腑组织失于营养，瘀血、痰浊内生;经络、腠理、络脉壅塞，营卫弥散、交会、气化障碍，营卫的营养、防御等功能减退，导致面部皮肤衰老[2]。补益营卫方由人参，生黄芪，炙甘草组成。方味虽少，但配伍精当。方中人参味甘，微苦，性平，具有补气与阴液双重作用;黄芪味甘性温，入表实卫，再加益气调和的炙甘草，共奏补益营卫之功效。本实验拟在中医营卫理论指导下研究补益营卫方对衰老表皮结构蛋白K18的影响，探讨补益营卫方对衰老表皮结构蛋白的影响。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验药物 补益营卫方组成：人参、生黄芪、炙甘草。由本校药学院中药制备教研室加工、浓缩成1 g/mL（每毫升含1 g生药），用时用蒸馏水配制成所需浓度。胎牛血清（澳GIBCO）;DMEM（High Glucose）及磷酸盐缓冲液（BI）;D-Hanks液、中性蛋白酶（北京酷来博科技有限公司）;K-SFM角质细胞培养基（深圳市阿拜尔科技发展有限公司）;Trizol试剂（BioFlux公司）。
　　1.2 实验动物 清洁级昆明种雌性小鼠，3月龄（年轻组）1只;14月龄（老年组）10只。均由宁夏医科大学动物中心提供。本研究所有动物实验操作，经过宁夏医科大学实验动物中心实验动物福利伦理委员会审核，符合国家实验动物福利伦理的相关规定。
　　1.3 仪器 HF-90恒温CO2培养箱（Thermo Scientific）、CKX31倒置顯微镜（OLYMPUS Corporation）、TDL-40B低速离心机（上海安亭科学仪器厂）、PCR梯度扩增仪（北京索莱宝生物有限公司）、Rotor-Gene 3000 RealTimePCR仪（Corbett Research）等均由宁夏医科大学科技中心提供。
　　2 方法 　　2.1 年轻及老年小鼠、细胞分离、培养 分别取年轻及老年小鼠背部皮肤，D-Hanks液中浸洗，剪成10mm×5mm小块，使用中性蛋白酶消化1.5h。分离获取表皮，制得表皮细胞悬液。接种于培养皿中。37℃、5%CO2条件下培养传代。其中老年组细胞分为2组，一组常规培养，一组用含2.5%药物的培养基培养;年轻组常规培养。48h后收集细胞用于指标检测。
　　2.2 Western Blot检测K18蛋白表达 细胞胰酶消化后，裂解，离心取上清液。BCA法计算出各组样品的蛋白浓度。电泳，转膜，封闭后，一抗孵育过夜。加入二抗，反应结束后，显色。使用G：BOX chemiXR5成像，使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。测定分析目的条带与内参GAPDHH灰度值之比来反应蛋白表达水平。
　　2.3 Real-time PCR法检测K18基因表达 充分裂解的细胞后，提取总RNA，并测定总RNA的含量和纯度。根据总RNA的含量，合成cDNA第一链，进行PCR扩增。反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸40s（依次循环40次），72℃，5min，每组别做三次定量检测。以GAPDH作为内参照，引物由南京凯基生物公司设计序列：GAPDH上游引物5′-TATGTCGTGGAGTCTACTGGT-3′;下游引物5′-GAGTTGTCATATTTCTCGTGG-3′。K18正向引物5′-TCAAGATCATCGAAGACCTGAGG-3′;K18反向引物5′-GCGCATGGCTAGTTCTGTC-3′。
　　2.4 统计分析 采用统计软件SPSS21.0进行统计学分析，实验数据均采用均数±标准差（x±s）表示，多组均数采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用方差分析、LSD检验。检验水准α=0.05。
　　3 结果
　　3.1 补益营卫方对衰老表皮细胞K18蛋白表达的影响（图1） 与年轻组比较，老年组表皮细胞K18蛋白水平表达显著升高（P<0.05）;与老年组比较，经2.5%补益营卫方药物干预后，衰老表皮细胞K18蛋白水平表达显著降低（P<0.05）;提示补益营卫方对衰老小鼠表皮K18蛋白水平表达具有一定的抑制作用。
　　3.2 补益营卫方对衰老小鼠表皮K18mRNA水平表达的影响 如图2所示。与年轻组比较，老年组表皮细胞K18mRNA表达水平上升（P<0.05）;经2.5%药物干预后，衰老表皮细胞K18mRNA表达水平明显降低（P<0.05）;提示补益营卫方对衰老小鼠表皮K18mRNA表达水平有一定的抑制作用。
　　4 讨论
　　随着人们生活质量逐步提高，人们对美的追求层次也越来越高。皮肤衰老，严重影响了人们对美好生活的需要。中医中药在此有着独特的优势。数千年中，中医药对衰老形成了丰富的认识。
　　营卫与皮肤具有密切关系。皮肤功能主要包括保护、感觉、吸收、分泌和排泄、调节体温、代谢、免疫等。《灵枢·本脏》中：“卫气者，所以温分肉，充皮肤，肥腠理，司开阖者也。”及《灵枢·邪客》：“营气者，泌其津液，注之于脉，化以为血。”充分说明皮肤这些生理功能的正常运行是依赖于营卫二气的充养作用。
　　人体的自然衰老，最易发现的表现是皮肤衰老。《素问·上古天真论》中：“女子五七阳明脉衰，面始焦，发始堕，六七三阳脉衰于上，面皆焦，发始白”，“丈夫六八阳气衰竭于上。”都说明人自然衰老时，由于阳气衰竭会出现面部的衰老。这是因为脾胃是气血化生之源，足阳明胃经又是多气多血之脉，且上循面部;人体衰老时阳气不足，首先从足阳明胃经反映在脸部，从而出现面部的皮肤衰老。营卫之气都化生于中焦脾胃。《素问·痹论》云：“荣者，水谷之精气也，”，“卫者，水谷之悍气也”。说明了营卫不足是皮肤衰老的重要病理基础之一，所以补益营卫是延缓皮肤衰老的主要手段之一[3-7]。历代医家在调和营卫时，所用药物药性以温性、平性为主，药味以甘、辛和苦为主，归经稍侧重于脾经，功效以补虚药和解表药为主[8]。为此，笔者从“营卫不足”的病机着眼，选取了补虚药，去掉了解表力较强的中药。使用补益营气的人参，益卫气的生黄芪，再加益气调和药性的炙甘草组成了补益营卫方。方中人参味甘，微苦，性平，具有补气与阴液双重作用;黄芪味甘性温，入表实卫，再加益气调和的炙甘草，共奏补益营卫之功效。因此，本实验从补益营卫的角度出发，探讨补益营卫方对衰老皮肤表皮中角蛋白K18的表达影响。
　　衰老是细胞损伤时间积累的过程。到达一定程度时，即使在最适合细胞生长的环境下，细胞会减少分裂。随着每次细胞增殖，DNA复制端粒DNA会逐渐变短，进而产生细胞染色体组成不稳定，使细胞进入凋亡期[9]。细胞凋亡是机体的一种正常细胞的更新和异常细胞清除。在病理状态下异常的凋亡又与肿瘤等多系统疾病的发生发展密切相关[10-12]。
　　中间纤维（intermediate filament，IF）是高等的真核细胞细胞骨架结构之一。角蛋白（keratin）是最大的IF亚组。角蛋白在皮肤和相关结构中可以看到不同的表达[13]。Moll等人把角蛋白分成20种[14]。其中最主要的是角蛋白Ⅰ型和Ⅱ型。K18属于Ⅰ型细胞角蛋白，是上皮细胞特异性表达的一类蛋白。其在细胞凋亡过程中在特定位点氨基酸Asp396被具有活性半胱天冬酶（Caspase）剪切，形成三个片段[15]。当上皮细胞发生坏死时，完整的K18会释放到细胞外，表示整体细胞死亡[16]。即K18的量反映了细胞死亡（细胞凋亡和坏死）的总体情况。
　　本研究采用蛋白免疫印迹法（Western blot）及实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）分别检测细胞K18蛋白、mRNA表达水平，从分子生物学角度探究补益营卫方延缓皮肤衰老的机制。实验结果显示，与年轻组比较，老年组的K18蛋白及mRNA表達水平显著升高，两者之间有显著统计学意义（P<0.05），提示衰老组表皮上皮细胞的凋亡水平明显高于年轻组;经药物干预后，衰老表皮细胞中K18蛋白及mRNA表达水平显著降低（P<0.05），说明经补益营卫方干预后衰老表皮上皮细胞的凋亡受到了抑制，提示其通过降低K18蛋白及mRNA表达水平抑制衰老表皮细胞凋亡发挥延缓皮肤衰老作用。 　　综上所述，可以看出补益营卫方通过有效抑制衰老皮肤表皮K18蛋白及mRNA表达而延缓皮肤衰老，其深层机制涉及抑制细胞凋亡。
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　　（收稿日期：2019-10-28）
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