鳖甲煎丸对腹膜透析相关腹膜纤维化的影响及 机制探讨
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[摘要] 目的 探討鳖甲煎丸对腹膜透析（PD）小鼠腹膜纤维化的抑制作用及可能机制。 方法 采用ICR小鼠4.25%腹透液2.0 mL每日腹腔注射一次，并于第3、5、7天联合脂多糖0.8 mg/kg腹腔注射造模;鳖甲煎丸1.2 g/kg每日灌胃一次，干预6周后，测腹透超滤量，HE染色和Masson染色观察壁层腹膜形态改变及腹膜厚度;Western blot检测脏层腹膜组织N-cadherin、ZO-1的蛋白表达水平，及pAkt、总Akt的蛋白表达水平。 结果 腹膜透析（PD）组、鳖甲煎丸（BJJW）组与对照（Control）组比较，超滤量均显著下降（P<0.05）;壁层腹膜均显著增厚（P<0.01）。脏层腹膜ZO-1蛋白表达降低，N-cadherin蛋白表达升高，pAkt也明显升高（均P<0.01）。BJJW组与PD组比较，超滤量明显改善（P<0.05），壁层腹膜厚度降低（P<0.01）;脏层腹膜ZO-1蛋白表达增加，N-cadherin蛋白表达下降，pAkt也明显下降（均P<0.01）。 结论 鳖甲煎丸抑制腹膜纤维化，PI3K/Akt信号调节腹膜间皮细胞上皮-间质细胞转分化（EMT）是其机制之一。
[关键词] 鳖甲煎丸;腹膜透析;腹膜纤维化;上皮-间充质转分化;PI3K/Akt信号
[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2020）09-0032-04
[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of Biejiajian pill on peritoneal fibrosis in peritoneal dialysis（PD） mice and its possible mechanism. Methods ICR mice were injected intraperitoneally with 4.25% peritoneal dialysis solution 2.0 mL once a day， combined with lipopolysaccharide 0.8 mg/kg on the 3rd， 5th and 7th day to build model. Biejiajian pill 1.2 g/kg were administrated daily by gavage. After 6 weeks of intervention， the volume of peritoneal ultrafiltration was measured， HE staining and Masson staining were used to observe the changes in peritoneal morphology and peritoneal thickness of the parietal peritoneum. Western blot was used to detect the expression levels of N-cadherin and ZO-1， pAkt and total Akt in visceral peritoneal tissue. Results Compared with that of the control group， the volume of peritoneal ultrafiltration in the peritoneal dialysis（PD） group and Biejiajian pill（BJJW） group was significantly lower（P<0.05）， and the parietal peritoneum in PD group and BJJW group was significantly thickened（P<0.01）. Visceral peritoneal ZO-1 protein expression was reduced， N-cadherin protein expression was increased， and pAkt was also significantly increased（P<0.01）. Compared with that of the PD group， the volume of peritoneal ultrafiltration in BJJW group was significantly improved， and the peritoneal thickness of the parietal peritoneum decreased（P<0.05）. The visceral peritoneal ZO-1 protein expression increased， N-cadherin protein expression decreased， and pAkt also significantly decreased（all P<0.01）. Conclusion Biejiajian pill inhibits peritoneal fibrosis， and the regulation of epithelial to mesenchymal transition（EMT） of peritoneal mesothelial cells from PI3K/Akt signal is one of its mechanisms.
[Key words] Biejiajian pill; Peritoneal dialysis; Peritoneal fibrosis; Epithelial to mesenchymal transition; PI3K/Akt signal 腹膜透析（Peritoneal dialysis，PD）因为腹膜纤维化而导致超滤失败，已成为患者退出腹膜透析的主要原因之一[1]。腹膜间皮细胞上皮-间皮细胞转分化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腹膜透析发生腹膜纤维化的基础[2，3]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3-kinase/Protein kinase B，PI3K/Akt）信号通路，可调节PD腹膜间皮细胞EMT的发生，导致腹膜纤维化的发生和发展，PI3K/Akt信号为腹膜纤维化防治的新靶点[4，5]。鳖甲煎丸用于胁下癥块，具有活血化瘀、软坚散结的作用。鳖甲煎丸具有显著的抗肝、肾、肺纤维化作用[6-9]，但未见治疗腹膜纤维化的报道。本研究通过超滤量、壁层腹膜厚度等指标观察鳖甲煎丸治疗腹膜透析小鼠腹膜纤维化的疗效;并通过观察脏层腹膜组织ZO-l、N-cadherin及pAkt等蛋白表达水平，从PI3K/Akt信号调节EMT的角度探讨鳖甲煎丸干预腹膜纤维化的机制，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 实验动物
清洁级雄性ICR小鼠24只，鼠龄6～8周，体重25～30 g，购自福建医科大学实验动物中心，合格证号[SCXX（闽）2016-0002]。于12 h光照、恒温（22±2）℃、40%～60%相对湿度条件下标准饲料喂养，自由饮水。常规适应性喂养1周后进行实验。动物实验过程遵守福建中医药大学关于动物实验伦理学的相关规定。
1.2 主要试剂
鳖甲煎丸（50 g/瓶，国药准字Z42020772，国药集团中联药业有限公司）;4.25%腹膜透析液（广州百特医疗用品有限公司）;脂多糖：sigma，货号L2880;抗phospho-Akt1Ser473抗体9018S、抗Akt1抗体2398S（美国CST）;抗ZO-1（ab216680）、N-cadherin（ab18203）、GAPDH抗体（ab181602）（Abcam公司）;HRP标记的兔二抗（Abcam公司）;BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、超敏ECL化学发光试剂盒（碧云天）。
1.3 模型制作与给药方法
24只ICR小鼠均分三组（n=8）：（1）对照（Control）组，左下腹腹腔注射（Intraperitoneal injection，ip）生理盐水2.0 mL，每日一次。（2）腹膜透析（PD）组，4.25%腹透液2.0 mL左下腹ip，每日一次，并于第3、5、7天联合ip脂多糖（Lipopolysaccharide，Lps）0.8 mg/kg造模，即脂多糖加生理盐水配成0.08 mg/mL，按0.1 mL/10 g每日ip一次;对照组予匹配同量生理盐水。（3）鳖甲煎丸（BJJW）组，造模同腹膜透析组，给予鳖甲煎丸（1.2 g/kg）加纯净水配成0.12 g/mL溶液，按0.1 mL/10 g每日灌胃一次。其余两组予纯净水0.1 mL/10 g每日灌胃一次。干預6周。
1.4 试验取材
第42天透析1 h末，用4%水合氯醛麻醉小鼠。在腹部中线部位作切口，用无菌纱布仔细吸附收集腹透液，并准确计量纱布增重，计算各组小鼠超滤量。留取各组小鼠右侧壁层腹膜，用10%中性缓冲液福尔马林固定24 h后石蜡包埋，4 μm切片行苏木素-伊红（hematoxylin and eosin stain，HE）染色及马松（Masson）染色。留取脏层腹膜立即置于液氮中保存，后续转移至-80℃冰箱保存，用于后续Western blot检测。
1.5 观察指标
（1）观察各组小鼠一般情况，每日测量体重并准确记录。（2）准确测量记录各组小鼠的腹膜透析超滤量。（3）HE染色：观察小鼠壁层腹膜间皮下基质，炎症细胞、成纤维细胞浸润。（4）Masson染色：观察壁层腹膜纤维化情况，并测量腹膜间皮下基质厚度，每个标本随机选取10个高倍镜视野，取平均值作为厚度。（5）Western blot检测脏层腹膜组织间皮细胞EMT指标N-cadherin、ZO-1的蛋白表达水平，及pAkt、总Akt的蛋白表达水平。磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂cocktail各10 μL加入1 mL的RIPA裂解液;取约50 mg -80℃冻存的脏层腹膜组织，加入蛋白裂解液后冰上超声充分粉碎，低温离心后取上清液，BCA法测组织的蛋白浓度，采用10%SDS-PAGE电泳，转膜、封闭后分别加入抗小鼠的Akt1（1∶1000）、p-Akt1（1∶1000）、ZO-1（1∶1000）、N-cadherin（1∶1000）、GAPDH（1∶2000）抗体，4℃过夜，1：5000稀释的HRP标记的相应二抗室温孵，化学发光成像仪曝光显像，采用ImageJ图像处理软件对条带灰度进行半定量分析。
1.6 统计学方法
采用Graphpad prism 8.0软件进行分析，实验数据中的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组小鼠实验期间体重变化比较
各组小鼠实验期间左下腹腹腔注射不断更换注射部位，无明显硬结，腹膜透析耐受性良好，无小鼠死亡。实验开始时体重无差异（P>0.05），腹膜透析组和鳖甲煎丸组注射Lps期间稍萎靡，体重增长偏慢，此后体重逐渐增长，到实验结束时两组体重虽较对照组略减轻，但无显著性差异（P>0.05）。BJJW组体重虽略重于PD组，也无统计学差异（P>0.05）。见表1。
2.2 三组小鼠腹膜透析超滤量及壁层腹膜厚度变化比较
PD组、BJJW组腹膜透析超滤量与Control组比较，超滤量均显著下降（P<0.05）;BJJW组与PD组比较，其超滤量明显改善（P<0.05）。见表2。 2.3 三组小鼠腹膜组织形态学改变比较
HE染色，对照组小鼠壁层腹膜间皮下基质薄，少见有炎症细胞浸润;PD组可见腹膜基质增多、有核细胞浸润增多;而BJJW组上述改变明显减轻。MASSON染色，PD组、BJJW组与Control组比较，腹膜组织显著增厚（P<0.01）。BJJW组与PD组比较，腹膜厚度相应改善（P<0.01）。见表2、封三图1。
2.4 三组小鼠脏层腹膜N-cadherin、ZO-1、Gapdh蛋白表达水平比较
ZO-1/Gapdh灰度比值（Control组：0.45±0.02;PD组：0.16±0.01;BJJW组：0.33±0.02）;N-cadherin/Gapdh灰度比值（Control组：0.14±0.01;PD组：0.53±0.02;BJJW组：0.35±0.01）;PD组、BJJW组与Control组比较，上皮细胞标志物ZO-1蛋白表达降低，间充质细胞标志物N-cadherin蛋白表达升高（均P<0.01）。BJJW组与PD组比较，ZO-1蛋白表达增加，N-cadherin蛋白表达下降（均P<0.01）。见图1。
2.5 三组小鼠脏層腹膜pAkt、Akt蛋白表达水平比较
pAkt/总Akt灰度比值（Control组：0.15±0.01;PD组：0.43±0.01;BJJW组：0.26±0.02）;PD组、BJJW组与Control组比较，Akt磷酸化水平（pAkt）也明显升高（均P<0.01）。BJJW组与PD组比较，pAkt明显降低（均P<0.01）。见图2。
3 讨论
腹膜透析因为腹膜纤维化而导致超滤失败已成为患者退出腹膜透析的主要原因之一[1]。在长期的腹膜透析过程中高糖及反复发生的腹膜炎是导致腹膜纤维化的主要原因[2]。腹透液高糖、高渗等因素可致腹膜间皮细胞间充质转分化，引起腹膜纤维化[10，11]。腹膜透析相关性腹膜炎其炎症相关因子作用于腹膜间皮细胞亦可导致腹膜纤维化[2，12]。故本研究采用4.25%腹透液联合第3、5、7天脂多糖0.8 mg/kg腹腔注射造模，贴近临床;PD组腹膜透析超滤量与对照组比较，超滤量显著下降（P<0.05）;壁层腹膜病理形态可见腹膜基质层胶原增多，炎症细胞浸润;腹膜组织显著增厚（P<0.01），提示小鼠建立腹膜纤维化模型成功。
研究表明腹膜间皮细胞EMT是腹膜纤维化的早期、可逆性环节，是促进腹膜纤维化发生发展的关键因素[3，13]。腹膜间皮细胞EMT表现为上皮细胞标志物如ZO-1、E-cadherin等表达降低，而间充质标志物如N-Cadherin、Vimentin、α-SMA表达升高。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）是细胞质内的脂类激酶，具有蛋白激酶活性，PI3K的主要下游是丝氨酸/苏氨酸激酶Akt。PI3K/Akt信号调节细胞增殖与分化，在纤维化中发挥重要作用[5，14]。已有研究证实PI3K/Akt信号通路参与调节PD腹膜间皮细胞EMT的发生，促进腹膜纤维化[4，5]。本课题亦发现PD组与Control组比较，脏层腹膜组织ZO-1蛋白表达降低，N-cadherin蛋白表达升高，pAkt也明显升高（均P<0.01），证实PI3K/Akt信号为腹膜纤维化的防治靶点。
近年临床及实验研究证实，中医药防治腹膜纤维化取得明显的效果，并发现单味中药及复方中药可通过多靶点防治PD腹膜间皮细胞EMT进展[15];单药如黄芪、丹参、川芎、三七、大黄等（包括其有效成分），复方如肾康注射液、参芎注射液、扶肾颗粒等，介导EMT的信号通路众多，目前研究主要涉及TGF-β/Smad信号通路和Notch信号通路[13]。鳖甲煎丸出自《金匮要略·疟病脉证并治第四》，用于胁下癥块，具有活血化瘀、软坚散结的作用。鳖甲煎丸多用于抗肝纤维化。腹膜纤维化中医亦属于“微型癥积”、“血瘀证”范畴[15]。鳖甲煎丸干预腹膜纤维化切合中医病机。
本研究以鳖甲煎丸干预腹膜透析相关性腹膜纤维化小鼠6周，BJJW组与PD组比较，其超滤量明显改善（P<0.05），壁层腹膜厚度也相应减轻（P<0.01）;脏层腹膜组织ZO-1蛋白表达增加，N-cadherin蛋白表达下降，Akt磷酸化水平（pAkt）也明显降低（均P<0.01），提示鳖甲煎丸可改善腹膜超滤功能，抑制腹膜纤维化，PI3K/Akt信号调节腹膜间皮细胞上皮-间质细胞转分化是其机制之一。本研究扩大了古方的实验研究范围，为下一步继续筛选鳖甲煎丸的中药组分干预腹膜纤维化打下基础。
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（收稿日期：2020-03-06）
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