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壮药白花九里明对保护肝细胞结构与功能的研究 ??

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   【摘要】 目的:在四氯化碳(CCl4)誘导肝细胞损伤小鼠模型中,探讨白花九里明提取液对肝细胞结构与功能的保护作用。方法:取60只KM小鼠随机均分为6组。正常对照组和模型对照组给予0.9% NaCl注射液,水飞蓟宾组给予0.42%水飞蓟宾溶液,白花九里明低、中、高浓度组分别给予15%、30%、60%的白花九里明提取液,每天灌胃1次;同时正常对照组给予0.9% NaCl注射液,其余组给予0.2%CCl4溶液,隔2天腹腔注射1次。末次用药30 min采血分离血清、取肝右叶制备组织切片。检测血清谷丙转氨酶(ALT)活性、丙二醛(MDA)含量,镜下检测肝组织结构变化。结果:模型对照组和低浓度组ALT、MDA均高于正常对照组和水飞蓟宾组(P<0.05),而模型对照组和低浓度组ALT、MDA差异无统计学意义(P>0.05)。水飞蓟宾组ALT、MDA与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。中浓度组ALT高于正常对照组,低于模型对照组(P<0.05),而与水飞蓟宾组比较差异无统计学意义(P>0.05);中浓度组MDA高于正常对照组(P<0.05),而与其余组比较差异无统计学意义(P>0.05);高浓度组ALT、MDA均低于模型对照组和白花九里明低浓度组(P<0.05),而与其余组无比较差异无统计学意义(P>0.05)。正常对照组肝细胞结构正常、形态清晰、无变性和坏死,肝小叶以中央静脉为中心肝索呈放射状排列规则;模型对照组和低浓度组肝细胞变性肿胀、形态模糊,可见肝细胞坏死区域,肝索排列紊乱,中央静脉管壁不完整、管内可见坏死的肝细胞碎片,肝小叶内有大量的白细胞浸润。水飞蓟宾组、白花九里明高浓度和中浓度组的肝细胞结构正常、形态清晰、没有明显的变性和坏死区域,肝索排列规则,中央静脉管内没有坏死的肝细胞碎片,肝小叶有少量的白细胞浸润。结论:白花九里明具有抵抗CCl4造成肝细胞损伤的作用,该作用存在量效正相关,高浓度的白花九里明对肝细胞结构和功能保护效应与临床保肝药物水飞蓟宾的效果相当。
   【关键词】 白花九里明 肝细胞 结构 功能 保护
   [Abstract] Objective: To investigate the protective effect of extract of Blumea Megacephala on the structure and function of hepatocytes in a mouse model of hepatocyte injury induced by tetrachloromethane. Method: Sixty KM mice were selected, and were randomly divided into 6 groups. The normal control group and model control group were given 0.9% NaCl injection, Silibinin group were given 0.42% Silibinin solution, and Blumea Megacephala low, medium and high concentration groups were given 15%, 30%, 60% Blumea Megacephala extract, irrigated gastric once a day. At the same time, the Normal control group was given 0.9% NaCl injection, the other groups was given 0.2% CCl4 solution, and injected intraperitoneally every 2 days. Blood samples were collected and serum was separated 30 min after the last administration of the drug, the right lobe of liver was taken for tissue section. The Serum ALT activity and MDA content were measured, and the histological changes of liver were examined under microscope. Result: The ALT and MDA of model control group and low concentration group were higher than those of normal control group and Silybin group (P<0.05). There was no significant difference in ALT and MDA between the model control group and the low concentration group (P>0.05), and no significant difference in ALT and MDA between the Silibinin group and the normal control group (P>0.05). The level of ALT in the medium concentration group was higher than that in the normal control group and lower than that in the model control group (P<0.05), but there was no significant difference compared with Silibinin group (P>0.05), MDA was higher than that of the normal control group (P<0.05), but there was no significant difference compared with other groups (P>0.05). The levels of ALT and MDA in the high concentration group were lower than those in the model control group and the low concentration group (P<0.05), but was no significant difference compared with the other groups (P>0.05). The normal control group had normal of liver cells structure, clear morphology, no degeneration and necrosis, liver lobules were arranged radially with the central vein as the center of the liver cable. The liver cells in the model control group and the low concentration group were denaturated swollen, had necrotic areas, liver cable arrangement was disordered, central venous wall were incomplete, and seen necrotic liver cells fragments in the tube, in the liver lobules have lot leucocyte infiltration. The Silibinin group, the high and medium concentration group had normal of liver cells, clear morphology, no obvious degeneration and necrosis, liver cable arrangement rules, no necrotic liver cells fragments in central venous tube, in the liver lobules had few leucocyte infiltration. Conclusion: Blumea megacephala have resistance of CCl4 induced liver cells injury, these is a positive correlation between dose and effect, the protective effect of high concentration of Blumea megacephala on liver cells structure and function is comparable to that of the clinical liver drug Silybin.   
   白花九里明[Blumea megacephala(Randeria) Chang et Tseng]为菊科植物,分布于广西的大部分地区,在广西壮族民间用于治疗跌打肿痛、风湿骨痛、月经不调、产后流血等[1-2]。近年的动物研究文献报道,白花九里明具有减弱心肌收缩力、降低血压、促进凝血、抗炎镇痛、护肝护胃等作用[3-8]。为了进一步认识白花九里明在肝细胞中的维护作用,本研究采用四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)制备小鼠肝损伤模型,与临床保肝药物水飞蓟宾相比较[9],检测肝细胞结构和血清谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,探索白花九里明对维护肝细胞结构与功能的作用,为白花九里明进一步开发应用提供实验依据,具体如下。
  1 资料与方法
  1.1 实验动物
   健康KM小鼠60只,雌雄各半,体重25~35 g,由右江民族医学院动物实验中心提供(实验动物生产许可证:SCXK桂2017-0003,实验动物使用许可证:SCXK桂2017-0004)。
  1.2 药品、试剂及器
   白花九里明采于广西壮族自治区百色市郊,晒干备用。0.9% NaCl溶液(青州尧王制药有限公司,批号:2218112103);水飞蓟宾胶囊(天津天士力圣特制药有限公司,批号:750711222);四氯化碳(CCl4,成都市科龙化工试剂厂,批号:20160520)。ALT测试盒、MDA测试盒 (南京建成生物工程研究所,批号:20190109、20190109),电子天平(诸暨市超泽衡器设备有限公司;型号:JM-B1003);多功能酶标仪(上壹桥国际贸易有限公司,型号:Tristar Lb941),三用恒温水箱(金坛市医疗仪器厂,型号:HH-W600);离心机(上海安亭科学仪器厂,型号:安亭 TGL-16G);数码显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司,型号:BA2100igital)。
  1.3 白花九里明提取液的制备流程
   将200 g白花九里明干草加入30 ℃左右的温水2 000 ml浸泡1 h,文火煮沸1 h,16层纱布过滤,保留滤液;滤渣再加入30 ℃左右的温水2 000 ml文火煮沸1 h,16层纱布过滤,两次滤液用文火隔水浓缩至200 ml(相当于生药100%),冷却后放入4 ℃冰箱保存,用时以蒸馏水配制成低、中、高浓度(15%、30%、60%)的白花九里提取液。
  1.4 动物分组与给药方法
   KM小鼠60只,雌雄各半,随机均分为6组,每组10只。正常对照组和模型对照组给予0.9% NaCl注射液,水飞蓟素组给予0.42%水飞蓟素溶液,白花九里明低、中、高浓度组分别给予15%、30%、60%白花九里明提取液,每天灌胃1次;同时正常对照组给予0.9% NaCl注射液,其余组给予0.2%CCl4溶液,隔2 d腹腔注射1次;持续30 d,用药量均按小鼠体重10 ml/kg计算。
  1.5 血清谷丙转氨酶(ALT)活性、丙二醛(MDA)含量检测
   末次用药前禁食12 h、禁水2 h,末次用药后30 min摘除眼球法采血离心分离血清,分别用ALT测试盒、MDA测试盒,通过酶标仪按说明书要求进行操作检测血清的ALT活性、MDA含量。
  1.6 肝组织切片的制备及检测
   在采血后立即剖腹取肝右叶浸泡于10%甲醛溶液固定30 min,脱水、石碏包埋、HE染色制成肝組织切片,用数码显微镜检查各组小鼠肝脏的组织结构并摄像。
  1.7 统计学处理
   采用SPSS 16.0统计软件对实验数据进行统计分析,计量资料以(x±s)表示,多组间均数比较采用方差分析,组间两两比较采用q检验,检验水准:α=0.05,双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 各组小鼠血清ALT酶活性、MDA含量结果比较
   模型对照组和低浓度组ALT、MDA均高于正常对照组和水飞蓟宾组(P<0.05),而模型对照组和低浓度组ALT、MDA差异无统计学意义(P>0.05)。水飞蓟宾组ALT、MDA与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。中浓度组ALT高于正常对照组,低于模型对照组(P<0.05),而与水飞蓟宾组比较差异无统计学意义(P>0.05);中浓度组MDA高于正常对照组(P<0.05),而与其余组比较差异无统计学意义(P>0.05);高浓度组ALT、MDA均低于模型对照组和白花九里明低浓度组(P<0.05),而与其余组无比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1。
  2.2 各组小鼠肝组织切片检查结果比较
   正常对照组肝细胞结构正常、形态清晰、无变性和坏死,肝小叶以中央静脉为中心肝索呈放射状排列规则;模型对照组和白花九里明低浓度组肝细胞变性肿胀、形态模糊,可见肝细胞坏死区域,肝索排列紊乱,中央静脉管壁不完整、管内可见坏死的肝细胞碎片,肝小叶内有大量的白细胞浸润。水飞蓟宾组、白花九里明高浓度和中浓度组肝细胞结构正常、形态清晰,无明显变性和坏死区域,肝索排列规则,中央静脉管内没有坏死的肝细胞碎片,肝小叶有少量的白细胞浸润,见图1、图2。
  3 讨论
   当机体组织细胞受到自由基攻击受损时,将产生脂质过氧化物导致血中MDA含量升高;ALT主要存在于肝细胞内,为胞内酶参与蛋白质合成,当肝细胞膜受损ALT通过损伤部位浸出进入血液中,将引起血中ALT升高;临床上采用检测血中的MDA含量来反映脂质过氧化物浓度、ALT升高来判断肝功能损害及程度的敏感指标[10-11]。    肝脏是机体消化腺,也是体内物质代谢的中心站,它还具有解毒、吞噬、防御等功能;而肝脏的基本功能和結构单位是肝细胞,当肝细胞受损可引发肝功能下降,使肝细胞变性甚至坏死、细胞膜破裂、血清ALT升高;自由基可破坏肝细胞膜引起脂质过氧化,使血清MDA含量升高[10-12]。
   本研究结果显示,模型对照组和白花九里明低浓度组的肝细胞变性肿胀、形态模糊,可见肝细胞坏死区域,肝索排列紊乱,中央静脉管壁不完整、管内可见坏死的肝细胞碎片,肝小叶内有大量的白细胞浸润;模型对照组和白花九里明低浓度组ALT、MDA均高于正常对照组和水飞蓟宾组,而模型对照组和白花九里明低浓度组ALT、MDA互相比较均无显著性差异。提示CCl4导致机体自由基对肝细胞膜造成脂质过氧化损伤,模型对照组和白花九里明低浓度组的肝细胞结构和功能严重受损,两组受损程度相当;说明CCl4制备肝损伤模型获得成功,低浓度白花九里明不能抵抗CCl4对肝细胞结构与功能的损伤。
   本研究结果还显示,水飞蓟宾组、白花九里明高浓度和中浓度组肝细胞结构正常、形态清晰、没有明显的变性和坏死区域,肝索排列规则,中央静脉管内没有坏死的肝细胞碎片,肝小叶有少量的白细胞浸润;水飞蓟宾组ALT、MDA均低于模型对照组,并与正常对照组比较均无显著性差异;白花九里明中浓度组ALT、MDA均高于正常对照组,而ALT明显低于模型对照组;白花九里明高浓度组ALT、MDA明显低于模型对照组和白花九里明低浓度组,而与其余组无显著性差异。提示水飞蓟宾组和白花九里明高浓度组的肝细胞结构和功能正常,没有明显受损的表现,白花九里明中浓度组的肝细胞结构和功能呈现轻度受损;说明白花九里明具有抵抗CCl4造成肝细胞损伤作用,该作用存在量效正相关,高浓度的白花九里明对肝细胞结构和功能维护作用与临床保肝药物水飞蓟宾的效果相当。
   综上所述,CCl4引发机体自由基损害肝细胞的结构和功能,白花九里明具有干预自由基造成的肝细胞损害达到维护肝细胞的正常结构和功能。说明白花九里明存在增强肝细胞抵抗损害和维护结构与功能的有效成分,这些有效成分有待于今后的进一步研究。
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  (收稿日期:2019-12-03) (本文编辑:马竹君)
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