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HOXD13蛋白N-端非多聚丙氨酸延展突变导致并多指(趾)家系表型的分析

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   【摘要】 目的:对一并多指(趾)家系进行基因突变检测,以期发现致病基因突变。方法:提取家系可追溯到的并多指(趾)患者外周血的基因组DNA。以特异的引物经聚合酶链反应扩增HOXD13基因的两个外显子及外显子/内含子交界区域,然后对PCR产物直接进行测序。BLAST比对分析家系患者HOXD13基因序列。突变导致的氨基酸改变位点在不同物种的保守性分析。结果:BLAST比对分析发现患者突变为c.64G>T(p.A22S),该突变位点在不同生物中高度保守。结论:c.64G>T(p.A22S)可能为该家系的致病突变。
   【关键词】 肢端畸形 突变筛查 并多指(趾)畸形
   [Abstract] Objective: To find out the mutation of pathogenic gene, the gene mutation of a pedigree with synpolydactyly was detected. Method: Genomic DNA from peripheral blood of patients with traceable polydactyly was extracted. Two exons and exon / intron junction regions of HOXD13 gene were amplified by polymerase chain reaction with specific primers, and then the PCR products were sequenced directly. BLAST was used to compare the HOXD13 gene sequence of patients with genebank sequence. Evolutionary conservation of amino acids flanking the mutations were analyzed. Result: The comparative analysis of BLAST revealed that the patient was mutated to c.64G > T (p.A22S), which was highly conserved in different organisms. Conclusion: c.64G > T (p.A22S) may be a pathogenic mutation in this family.
  
   并多指畸形(synpolydactyly, SPD)是一種常染色体显性肢体畸形,通常由3/4指和4/5趾并指组成,3/4并指蹼内有一个中心重复指。SPD(OMIM 186000),是由HOXD13基因突变引起的,HOXD13是肢体发育中起关键作用的转录因子。HOXD13有两个外显子:外显子1编码含15个丙氨酸残基的多聚丙氨酸链,外显子2编码含有60个氨基酸残基的同源盒结构域(残基268-327)。通过同源结构域结合特定的DNA序列,HOXD13直接调节早期肢体前-后轴和相关的关键基因[1]。HOXD13蛋白的多聚丙氨酸链延展突变和同源结构域错义突变都可引起SPD表型。本研究中分析了一个中国北方SPD家系,以HOXD13为候选致病基因对先证者进行了基因突变筛查,以期发现突变位点,现报道如下。
  1 资料与方法
  1.1 家系临床资料 于沈阳医学院中心医院手外科收集一并多指(趾)家系,通过直接检查或家系成员口述,了解患者的临床表现及其遗传学特征,绘制系谱图;与患者及其家属签署“知情同意书”,并经沈阳医学院学术委员会批准,对可追溯到的患者进行体格检查和足部外观拍照,并采集患者外周静脉血2 mL,血样-70 ℃保存备用。
  1.2 突变筛查 采用全血基因组DNA提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)提取基因组DNA。由上海生工生物公司合成三对PCR引物:E1-1F2/E1-1R2,E1-2F/E1-2R和E2F/E2R引物序列,退火温度和扩增片段长度见表1。采用即用型Taq酶PCR试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)进行50 μL标准体系(Mix 25 μL, 模板2.5 μL,上、下游引物各2.5 μL,ddH2O 17.5 μL)的PCR反应,扩增包含HOXD13基因的两个外显子及外显子/内含子交界区的三个DNA片段,反应条件为:94 ℃温度下变性5 min,退火30 s,72 ℃延伸45 s,共35个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定;经凝胶成像分析系统观察,并对扩增的强度和特异性进行初步估计,扩增成功的PCR产物送测序。
  E2R AAGCTGTCTGTGGCCAACC
  1.3 测序结果分析 与野生型测序图对比观察分析患者测序图,根据测序图提示的碱基序列在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast做同源性比较分析,确定碱基改变位置。根据已知HOXD13的基因开放阅读框,推测碱基改变是否影响mRNA剪切,或者导致编码氨基酸变化。检索SNP数据库,确定是否为已报道的单核苷酸多态性。
  1.4 突变位点对应氨基酸在不同物种的保守性分析 利用UCSC在线搜索工具(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin)来分析碱基改变所对应的氨基酸位点在不同物种之间的序列保守性。以推测对应氨基酸位点突变是否会引起肢端畸形。
  2 结果
  2.1 家系临床资料 本研究收集到的这一SPD家系共有2代患者,现存家系成员4人,其中患者2人(图1)。先证者为5岁女孩,其右足5趾多趾畸形(图2)。据家属陈述患儿父亲为左足4/5并趾畸形。无隔代遗传现象,男女患者均有受累,患者子代约1/2发病。家系畸形仅限于手足,患者除手足外无其他发育异常,手腕、脚踝活动未见异常,身高正常。   2.2 测序结果及分析 以Ⅱ-1患者基因组DNA为模板,扩增HOXD13基因的两个外显子及外显子/内含子交界区的三个DNA片段,PCR产物直接测序,HOXD13基因开放阅读框第64位碱基发生颠换突变c.64G>T测序图(见图3),该突变将导致mRNA第22位密码子GCC突变为TCC,相应HOXD13蛋白第22位氨基酸发生突变,从非极性丙氨酸(Ala, A)转化成极性丝氨酸(Ser, S),即p.A22S。
  2.3 突变位点对应氨基酸在不同物种的保守性分析 HOXD13蛋白第22位的丙氨酸p.A22在不同物种之间的高度保守,见图4。说明这一氨基酸位点对于HOXD13蛋白质的功能至关重要。
  3 讨论
   本研究收集到的这一中国北方SPD家系已经稳定遗传了至少2代,呈连续传递现象,且男女均有发病,该家系符合常染色体显性遗传模式。两代患者表型不同,但都符合SPD的典型表型。SPD是一种以手指或脚趾不完全分离和手指或脚趾数目增多为主要特征的遗传性远端肢体畸形。SPD主要是由HOXD13蛋白的多聚丙氨酸延展长度超过7个引起的。多聚丙氨酸延展导致SPD的机制,目前普遍认为突变蛋白自身不能入核,而且突变蛋白影响野生型HOXD13及其他5’HOXD蛋白的功能。因此其致病机制为显性负效应,突变蛋白半衰期变短[2-3]。除多聚丙氨酸链延展突变外,HOXD13基因同源盒结构域的突变也可导致并多指(趾)的发生[4]。在2016年,我国学者也在一个中国家系中发现了HOXD13基因同源异型结构域的错义突变引起的SPD畸形[5-7]。同源盒结构域突变的HOXD13不能结合DNA,这类表型可能是由HOXD13的单倍体不足引起的。
   2012年Brison等[8]报道了第一例HOXD13蛋白N-端非多聚丙氨酸区域的HOXD13G11A突变,突变蛋白没有改变亚细胞定位、DNA结合能力和转录调控功能,但是与野生型相比,蛋白质半衰期显著下降、HOXD13G11A与GLI3R在前部肢芽的亲和力增强导致GLI3R过早降解。GLI3是调控人类肢芽发育的前后轴方向的重要信号分子[9-12]。GLI3蛋白具有特异的DNA亲和力,是肢体发育早期重要的转录因子[13-15]。GLI3是肢体发育过程中的主要调控因子,在拇指即将形成的区域,GLI3被加工成截短蛋白GLI3R,GLI3R增强细胞凋亡并抑制手指的形成。SHH抑制GLI3向GLI3R阻遏物形式的截短,从而产生GLI3激活物/GLI3R阻遏物梯度[16-17]。功能上冗余的5’HOXD基因調控手指模式,位于SHH和GLI3下游。HOX基因表达错误、SHH梯度异常或GLI3和GLI3R之间失去平衡都与手指畸形相关[18-21]。Brison等[8]等研究推测突变蛋白HOXD13G11A半衰期显著下降和HOXD13G11A与GLI3R在前部肢芽的亲和力增强是该家系致病原因。本文报道的c.64G>T突变是继Brison等[8]报道的HOXD13G11A N-末端非多聚丙氨酸的又一例N端突变。该突变导致22位氨基酸从非极性丙氨酸转化成极性丝氨酸,该氨基酸位点HOXD13A22S在不同物种间高度保守,提示c.64G>T突变可能为致病突变。突变HOXD13A22S是否会改变蛋白半衰期以及突变蛋白与GLI3R因子之间相互作用是否有变化,这些都需要进一步研究。
   综上所述,HOXD13基因突变与SPD发病密切相关,HOXD13蛋白C-末端同源盒结构域、N-末端多聚丙氨酸延展和非多聚丙氨酸延展区域的突变都可以导致其功能异常,从而导致SPD。SPD家系中致病基因突变鉴定对于临床开展遗传咨询和优生指导都有重要意义。
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  (收稿日期:2019-12-06) (本文編辑:姬思雨)
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