免疫层析法与PCR法对妊娠期妇女B族链球菌的检测效能比及阳性病例影响因素分析

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　　【摘要】 目的：探讨免疫层析法、实时荧光定量PCR法对妊娠期妇女B族链球菌的检测效能比，并分析阳性患者相关影响因素。方法：选择2018年4月-2019年7月于本院产检的妊娠晚期孕妇643例为研究对象，采集其阴道-直肠分泌物作为样本，分别用免疫层析法、实时荧光定量PCR法进行检测，检测前均对样本进行选择性肉汤培养基增菌。统计免疫层析法及PCR法的检测结果，并以细菌培养法为金标准，对各检验方法的灵敏度、特异度、准确性进行比较。对阳性患者及阴性患者的相关资料进行单因素及多因素Logistic回归分析。结果：免疫层析法GBS检测阳性率为11.8%，PCR法阳性检测率为11.4%，虽均高于增菌细菌培养法的9.5%，但差异均无统计学意义（P>0.05）。免疫层析法检测GBS的灵敏度63.9%，特异度93.6%，准确性90.8%。PCR法检测GBS的灵敏度73.8%，特异度95.2%，准确性93.2%。免疫层析法与PCR法阳性检出率、灵敏度、特异度、准确性比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。单因素分析结果显示，阳性患者与阴性患者的年龄>32岁、体重指数>24 kg/m2、妊娠合并糖尿病、妊娠期阴道炎、甲状腺功能减退、经产、流产史比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。Logistic回歸分析显示，年龄>32岁、妊娠合并阴道炎、妊娠合并糖尿病、甲状腺功能减退、经产、流产史均为B族链球菌感染的独立危险因素（P<0.05）。结论：增菌后免疫层析法与PCR法对妊娠期妇女B族链球菌的阳性检出率、灵敏度、特异度、准确性基本一致，免疫层析法操作简单，用时短，PCR法可批量操作，适应性也广，临床可根据受检者具体情况选择合理的检测方式。临床对高龄、合并阴道炎、合并糖尿病、甲状腺功能减退、经产、流产史的孕妇应加强B族链球菌的检测。
　　 【关键词】 免疫层析 PCR 妊娠 B族链球菌
　　 Analysis of the Detection Efficiency Ratio of Immunochromatography and PCR for Group B Streptococcus in Pregnant Women and the Influencing Factors of Positive Cases/JIN Xian， FAN Chunhui， ZHU Ping’an， TANG Hong， WU Yi， TAN Ping， CHEN Fang， HUANG Xiaotong. //Medical Innovation of China， 2020， 17（11）： 044-048
　　 [Abstract] Objective： To investigate the detection efficiency ratio of group B streptococcus in pregnant women by immunochromatography and real-time quantitative PCR， and to analyze the influencing factors of positive patients. Method： A total of 643 pregnant women in the third trimester who underwent prenatal examination in our hospital from April 2018 to July 2019 were selected as the study subjects. The vaginal-rectal secretions were collected as samples. Immunochromatographic method and real-time fluorescence quantitative PCR method were used for detection. The samples were selectively enriched by broth medium before detection. The results of immunochromatography and PCR were analyzed， and using bacterial culture as the gold standard， the sensitivity， specificity and accuracy of each method were compared. Univariate and multivariate Logistic regression analysis was performed on the data of positive and negative patients. Result： The positive rate of GBS by immunochromatography was 11.8%， and the positive rate of PCR was 11.4%， both of which were higher than 9.5% of the cultured bacteria， but the differences were not statistically significant （P>0.05）. The sensitivity， specificity and accuracy of GBS were 63.9%， 93.6% and 90.8% by immunochromatography. The sensitivity， specificity and accuracy of GBS were 73.8%， 95.2% and 93.2% by PCR. Comparing the positive detection rate， sensitivity， specificity and accuracy of the immunochromatographic method and the PCR method， the differences were not statistically significant （P>0.05）. The results of single factor analysis showed that the age of positive patients and negative patients were over 32 years old， body mass index > 24 kg/m2， gestational diabetes mellitus， gestational vaginitis， hypothyroidism， menstrual and abortion history， the differences were statistically significant （P<0.05）. Logistic regression analysis showed that age over 32 years old， pregnancy with vaginitis， pregnancy with diabetes mellitus， hypothyroidism， labor and abortion history were all independent risk factors for group B streptococcal infection （P<0.05）. Conclusion： The positive detection rate， sensitivity， specificity and accuracy of group B streptococcus in pregnant women were basically the same as that of PCR. The immunochromatographic method was simple to operate， and the time was short. Clinical can choose the reasonable detection method according to the patient’s specific situation. In clinic， the detection of group B streptococcus should be strengthened in pregnant women with advanced age， vaginitis， diabetes mellitus， hypothyroidism， labor and abortion history. 　　 [Key words] Immunochromatography Polymerase chain reaction Pregnancy Group B streptococcus
　　 First-author’s address： Shenzhen Yantian District People’s Hospital， Shenzhen 518081， China
　　 doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.11.011
　　 B族链球菌（group B streptococcus， GBS）是孕妇围产期常见的感染病原菌，也称无乳链球菌。目前各地区报道的GBS的检出率有所差异，检出率为5%～30%，可能与地区、种族及检测方法等因素有关[1-3]。部分成年女性本身就携带有GBS且大多不表現出临床特征，但是却极可能会在女性妊娠期间引起相应感染，尤其在妊娠晚期，孕妇感染GBS后可能影响妊娠结局，对孕产妇及新生儿造成不良后果，甚至危及生命。直接接种细菌培养法对试验条件要求较低，大多数医院基本都可完成，但是其检出率低，可能出现漏检，影响GBS治疗。已有文献表示，免疫层析法、PCR法可快速检测GBS，且检出率相对较高[4-5]。本研究主要结合本院GBS检测开展情况与相关文献，对选择性肉汤培养基增菌后分别采用免疫层析法、PCR法，并统计分析两种方法的检测效能比，同时通过Logistic回归分析B族链球菌感染的影响因素。现报道如下。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料 选择2018年4月-2019年7月于本院产检的妊娠晚期孕妇643例为研究对象，年龄22～39岁，平均（32.3±3.1）岁。（1）纳入标准：孕周35～37周。（2）排除标准：①1周内使用过抗菌药或阴道周围外用清洗剂;②存在认知、沟通障碍。孕妇知情且同意入组并签署知情同意书，本研究经本院医学伦理委员会同意批准。
　　1.2 方法与试剂
　　1.2.1 试剂与仪器 选择性肉汤培养基由青岛海博生物技术有限公司生产提供，血平板由郑州安图生物工程股份有限公司提供，细菌鉴定仪由法国生物梅里埃股份有限公司提供，型号VITEK2 COMPACT，免疫层析法试剂盒由北京金沃夫生物工程科技有限公司生产提供，全自动荧光定量PCR仪由美国应用生物系统公司提供，型号VIIA 7DX，GBS核酸检测试剂盒及阴、阳对照试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司生产提供。
　　1.2.2 方法 （1）标本采集：采集研究对象阴道-直肠分泌物标本。（2）增菌培养：采用无菌操作方法，将标本放入选择性肉汤培养基中增菌，在35 ℃的二氧化碳培养箱（浓度5%～10%）内培养18 h;（3）分离培养及鉴定：接种血平板，继续在35 ℃的二氧化碳培养箱（浓度5%～10%）内培养18 h。血平板上可疑GBS菌落为灰白色，外表光滑凸起，具有透光性。对可疑菌落进行生化鉴定，革兰染色阳性、触酶试验阴性、CAMP试验阳性，挑取单个菌落进行上机鉴定，鉴定为无乳链球菌。质控菌株选无乳链球菌和化脓链球菌分别做为阳性和阴性对照。（4）免疫层析法检测：增菌18 h后，留取
　　1 mL增菌液检测，操作方法严格按试剂盒要求进行。
　　（5）PCR法检测：增菌18 h后，留取1 mL增菌液离心后弃上清，加入DNA提取液，100 ℃裂解10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清5 μL做为模板进行PCR扩增并按试剂盒要求作结果判定。
　　1.3 观察指标及判定标准 统计免疫层析法与PCR法的阳性率，并以增菌后细菌培养法为金标准，对各检验方法的灵敏度、特异度、准确性及一致性进行对比分析。灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100%，特异度=真阴性/（真阴性+假阳性）×100%，准确性=真阳性+真阴性/总数×100%。（1）比较免疫层析法与增菌细菌培养法的检测结果。（2）比较PCR法与增菌细菌培养法的检测结果。（3）比较免疫层析法与PCR法检测效能比。（4）GBS感染的影响因素Logistic回归分析，统计研究对象中细菌培养法检测阳性的所有孕妇的年龄、体重指数、合并高血压、合并糖尿病、甲状腺功能、合并阴道炎、初产与经产情况、流产史等资料，并作为自变量，将GBS感染作为因变量，并采用Logistic回归分析这些因素与GBS感染的相关性。
　　1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用McNemar检验或字2检验;多因素采用Logistic回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 免疫层析法与增菌细菌培养法的检测结果比
　　较 免疫层析法GBS检测阳性率为11.8%（76/643），增菌细菌培养法检测阳性率为9.5%（61/643），两者比较，差异无统计学意义（P=0.067），免疫层析法检测GBS的灵敏度63.9%，特异度93.6%，准确性90.8%。见表1。
　　2.2 PCR法与增菌细菌培养法的检测结果比
　　较 PCR法GBS检测阳性率为11.4%（73/643），增菌细菌培养法检测阳性率为9.5%（61/643），两者比较，差异无统计学意义（P=0.096），PCR法检测GBS的灵敏度73.8%，特异度95.2%，准确性93.2%。见表2。
　　2.3 免疫层析法与PCR法检测效能比的比较 免疫层析法与PCR法阳性检出率、灵敏度、特异度、准确性比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表3。
　　2.4 阳性患者与阴性患者基本资料比较 单因素分析结果显示，阳性患者与阴性患者的年龄>32岁、体重指数>24 kg/m2、妊娠合并糖尿病、妊娠期阴道炎、甲状腺功能减退、经产、流产史比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;阳性患者与阴性患者妊娠合并高血压比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。 　　2.5 GBS感染的Logistic回归分析 Logistic回归分析发现年龄>32岁、妊娠合并阴道炎、妊娠合并糖尿病、甲状腺功能减退、经产、流产史均为B族链球菌感染的独立危险因素（P<0.05），见表5。
　　3 讨论
　　 GBS感染是临床发生率较高的妊娠晚期疾病，严重危害妊娠结局及新生儿健康。妊娠期的临床筛查是预防GBS感染的有效途径[6-7]。美国CDC自1996年至今共发布了三版妊娠期GBS筛查指南，我国在2010年开始公布妊娠期GBS筛查指南。指南中直接接种细菌培养法被各大医院广泛应用。主要是细菌培养法对实验设备及场地要求不高，容易操作。但是已有文献[8-9]表示，直接接种细菌培养法阳性检出率不高，临床容易出现漏诊。近年来，国内医院开始使用选择性肉汤培养基增菌后转种细菌培养。虽然选择性肉汤培养基转种耗时长，但是较多研究表示增菌后细菌培养阳性检出率更高[10-12]。另外有研究指出，临床采用免疫层析法或PCR法，可获得较好的阳性检出率，且检测便捷，可能更适合临床GBS筛查[13-14]。本研究基于上述文献，结合课题研究，对各种筛查方法进行研究讨论。另外，由于妊娠期妇女GBS的筛查并未纳入国内所有医院的常规检查项，而且也由于地域与种族等差异，GBS携带情况也不一样[15-16]，因此对于本地区妊娠期妇女GBS的影响应针对个体因素进行统计与分析。因此，本研究更进一步地对细菌培养法检测阳性的个体资料进行统计与分析，并采用Logistic回归分析其与GBS感染的相关性，以期分析出本地区妊娠期妇女GBS感染的独立危险因素，为临床GBS检测提供更多支撑依据。
　　 相关文献[17-18]报道，采用增菌后的标本进行检测，能够获得更高的阳性检出率。主要是因为直接培养法中菌种丰富，影响GBS的生长，加大了检测难度。而选择性肉汤培养基中包含有萘啶酸、黏菌素等抗菌药，能够有效抑制受检者阴道样本中非目标菌种（多数为革兰阴性菌）的生长，虽然对GBS也会产生轻度抑制作用，但选择性肉汤培养基中的链球菌生长营养成分可同时有助GBS的生长，更利于检出。因此，为了获得更加准确的检测结果，本研究免疫层析法、PCR法以及细菌培养法均采用增菌后标本。另外，笔者认为有条件的医院可以将选择性肉汤培养基增菌作为GBS检测的常规步骤，临床检验中能快速、便捷植入样本，保证检测时效性与准确性。对增菌后的样本使用免疫层析法与PCR法进行检测，结果显示免疫层析法GBS检测阳性率为11.8%，增菌细菌培养法检测阳性率为9.5%，两者比较，差异无统计学意义（P>0.05）。PCR法GBS检测阳性率为11.4%，增菌细菌培养法检测阳性率为9.5%，两者比较，差异无统计学意义（P>0.05）。另外，以增菌后细菌培养法检测为金标准，对免疫层析法与PCR法进行分析，结果显示免疫层析法的检测灵敏度（63.9%）低于PCR法检测灵敏度（73.8%），但两者比较，差异无统计学意义（P>0.05）。需增加样本量进一步研究其显著性。免疫层析法与PCR法在增菌后的检测特异度及准确性均较高，因为免疫层析法与PCR法可以忽略细菌培养法中GBS生长的情况，而且能够检出非β型溶血性GBS及CAMP阴性的GBS。免疫层析法检测简单快捷，仅需试剂盒及一些简单的试验设备，结果判读简单易操作，对工作人员专业水平要求不高，且检测时间短，30 min左右即可完成。但是相应的其检测灵敏度相对较低，适用于基层医院临床初步筛查，防止漏检。而PCR法操作相对复杂，配合全自动荧光定量PCR仪，检验2～3 h即可完成批量检测，结果判读也简单易行，但是基层地区可能不具备临床基因扩增实验室的条件，因此PCR法可作为有条件地区临床准确检测GBS的检测方式。
　　 另外，为了进一步为妊娠期妇女GBS感染检测提供更多临床依据，本研究对细菌培养法检测阳性的妇女进行个体相关因素回归性分析。从结果2.4可知，单因素结果显示阳性患者与阴性患者在年龄>32岁、体重指数>24 kg/m2、妊娠期阴道炎、妊娠合并糖尿病、甲状腺功能减退、经产、流产史比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;阳性患者与阴性患者妊娠合并高血压比较，差异无统计学意义（P>0.05）。多因素Logistic回归分析结果显示年龄>32岁、妊娠合并阴道炎、合并糖尿病、甲状腺功能减退、经产、有流产史的妊娠期妇女是感染GBS的独立危险因素。研究结果与国内其他地区有部分相同，但是也存在部分差异。吴丽娜等[19]研究指出年龄并非GBS感染的独立危险因素，不过在其研究中分析的年龄界限为30岁。龚明霞等[20]则分析出年龄35岁以上是感染GBS的独立危险因素。在本研究中，入组对象平均年龄在32岁左右，因此将年龄32岁作为分析界限。不过目前引起GBS感染的机制尚不明确，这些独立危险因素仅作为本院研究结果，可供本地区其他医院以及外地区医院作临床参考。
　　 综上所述，免疫层析法检测方便快捷，可作为基层医院妊娠晚期GBS初步筛查方式。PCR法具有可批量操作的优点，适应性也广。临床可根据受检者具体情况选择合理的检测方式，防止漏检误检。另外，对于本地区GBS检测为非常规检查项的医院，应注意对高龄、妊娠合并阴道炎、合并糖尿病、甲状腺功能减退、经产、有流产史的妊娠期妇女进行GBS筛查。
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　　（收稿日期：2020-02-06） （本文编辑：姬思雨）
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