姜黄素抑制胃癌多药耐药相关因子特性研究

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　　[摘要] 目的 探讨姜黄素抑制人胃癌SGC7901/ADR细胞增殖情况以及与多药耐药相关因子P170及GST-π表达规律的相关性。 方法 采用CCK-8检测不同浓度姜黄素对SGC7901/ADR细胞12 h、24 h、36 h的抑制情况;通过免疫细胞化学法分析各浓度梯度姜黄素作用36 h时P170及GST-π的表达差异;采用统计学方法进行分析。 結果 姜黄素作用于人胃癌SGC7901/ADR耐药细胞剂量越高、时间越长吸光度越低（P<0.05），各浓度梯度姜黄素作用36 h时GST-π阳性表达有降低趋势，但无统计学意义（P>0.05），而与P170阳性表达则无直接关联性。 结论 姜黄素可抑制人胃癌SGC7901/ADR耐药细胞的增殖，可能抑制GST-π的表达。
　　[关键词] 姜黄素;SGC7901/ADR细胞株;多药耐药;P170;GST-π
　　[中图分类号] R735.2          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2020）10-0034-03
　　[Abstract] Objective To investigate the inhibition of Curcumin on the proliferation of human gastric cancer SGC7901/ADR cells and the relationship between Curcumin and the expression of multidrug resistance related factors P170 and GST-π. Methods Cell counting kit-8（CCK-8） was used to detect the inhibition of Curcumin at different concentrations on SGC7901/ADR cells for 12， 24 and 36 hours; immunocytochemistry was applied to analyze the differences of P170 and GST-π expression at 36 hours after Curcumin treatment at different concentrations; statistical method was used to analyze the results. Results The higher the dose of Curcumin on SGC7901/ADR cells and the longer the time， the lower the absorbance（P<0.05）. After 36 hours of Curcumin treatment at different concentrations， the positive expression of GST-π decreased， and the difference was not statistically significant（P>0.05）， and had no direct correlation with positive expression of P170. Conclusion Curcumin can inhibit the proliferation of SGC7901/ADR cells， and may inhibit the expression of GST-π.
　　[Key words] Curcumin; SGC7901/ADR cell line; Multidrug resistance; P170; GST-π
　　近年来相关研究表明，从中草药姜黄中分离出的多酚-姜黄素（Curcumin）对胃癌的治疗具有积极意义，特别是其对化学治疗的增效性及抗耐药性[1]。胃癌是我国发病率及死亡率很高的消化道恶性肿瘤，但目前其治疗效果仍不理想，主要原因是肿瘤所具备的多药耐药特性（multi-drug resistance，MDR）[2]。多药耐药是肿瘤细胞先天或后天具有对某种抗肿瘤药物的耐药特性，而且可能对其他结构特征、干扰机制、靶目标不尽相同的其他类型抗肿瘤药物具有耐药特性。经相关研究证实，其主要作用因子包括已知的P170和GST-π等，可多角度、多靶点干预胃癌的进程和预后，以及胃癌对化学药物MDR的强度，是近年肿瘤耐药及多药耐药的集中因子[3]。正是基于上述原因，我们着手研究姜黄素对胃癌多药耐药的抑制作用，从而为中草药抗肿瘤特别是胃癌的研究提供新思路。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料来源
　　胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR（第四军医大学西京医院全军消化病研究所）;姜黄素（Curcumin，C21H20O6=368.38）纯度≥65%（ALADDIN）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 采用CCK-8法检测细胞增殖情况  于培养孔板每孔中分别加入100 μL浓度为5×104/mL对数生长期细胞，置37℃、5% CO2培养箱中培养8 h，预留等比空白组。将姜黄用培养基等比稀释成细胞浓度梯度为0 μmol/L（对照组）、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L溶液，然后加到培养孔板中，每孔100 μL，每个浓度18个复孔（备份培养供进一步免疫细胞化学法分析使用）分别培养12、24、36 h，每孔加入CCK-8后采用酶标仪测定吸光度值（波长450 nm）。
　　1.2.2 免疫细胞化学法分析各浓度梯度姜黄素作用36 h时P170及GST-π的表达差异  选择实验时间组别姜黄素干预最充分的36 h时间点，按各梯度浓度组别从孵箱中取出培养36 h的细胞，用含EDTA的胰酶消化，分别取2 mL细胞悬液滴于培养孔板中，放入37℃、5% CO2孵箱中培养备用。清洗、固定、去除内源性过氧化物酶并湿盒室温孵育。将标本加入适量对应抗体1：100稀释，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯浸泡并中性树胶封片。 　　显微镜下逐一观察，阳性判断标准为：选用已知阳性平片作对照，P170主要表达于细胞膜和细胞质，GST-π主要表达于细胞质，染色成棕黄色颗粒且间质不染色表达为阳性，染色强度依次定为棕褐色（+++）、棕黄色（++）、淡黄色（+）[4]。
　　1.3 统计学分析
　　使用SPSS17.0分析软件进行统计学处理分析，各数据经正态性檢验，非正态分布的资料经转换后比较，各计量资料采用（x±s）表示，两组组间比较采用LDS-t检验，多组间比较采用方差分析，各浓度梯度姜黄素与P170及GST-π表达的相关性采用Spearman法分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 姜黄素梯度浓度及时间对胃癌耐药SGC7901/ADR细胞株的影响
　　随时间及剂量梯度变化，姜黄素浓度及作用时间与吸光度呈反比，既抑制了胃癌耐药SGC7901/ADR细胞株的增殖，且差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
　　2.2 各浓度梯度姜黄素与P170及GST-π表达的相关性
　　姜黄素浓度强度分别对应为0 μmol/L（-）、50 μmol/L（+）、100 μmol/L（++）、150 μmol/L（+++）。充分培养36 h后，随浓度升高，GST-π阳性表达率均出现下降趋势，但采用Spearman法进行统计学分析后，差异无统计学意义（P>0.05），无明确相关性;而P170阳性表达率无明确相关变化趋势，见表2、3。
　　3讨论
　　肿瘤的多药耐药是肿瘤细胞本身具有的对特定抗肿瘤药物产生耐药的同时对其结构、作用机制、作用目标不尽相同的其他抗肿瘤药物存在耐药的特性[5]。多药耐药的发生机制较为复杂，已知可能的原因为：①跨膜转运引起的药物分子细胞内外分布失调，导致药物分子外泄;②调节细胞器靶点分布，从而隐藏药物靶点;③LRP的类膜泵效应胞吐药物分子;④细胞的自我修复过表达;⑤细胞的药物靶点突变，降低其对药物敏感性;⑥PKC过表达，促进相关蛋白磷酸活化;⑦凋亡基因的影响等[6]。有多种蛋白、信号通道及生物酶参与其中。如何减轻、抵消甚至逆转多药耐药，从而加强化学治疗的疗效，提升化学治疗的预后，已成为目前癌症治疗研究的重点之一[7]。特别是严重危害我国人民健康的胃癌，其手术后多需化学治疗，但其疗效同样受困于多药耐药的影响。P170、GST-π作为多药耐药基因的产物已被广泛证实与胃癌的多药耐药关系密切，可影响胃癌等肿瘤对化学治疗的多药耐药进程[6]。其中起到介导媒体的P170，对基因在多药耐药层面的重组、转录起到正向作用;而GST-π是一种广泛参与机体解毒的与蛋白结合的同工酶，一方面加强细胞毒的溶水性，将其代谢成为没有毒性的物质排出，又对细胞的自我修复起到指导作用，除去对细胞积极作用外，也导致了多药耐药的强势[8]。P170、GST-π均是明确的多药耐药相关因子。实际上MDR因素很多，且某些MDR因子还存在双刃剑机制，如p38MAPK信号通路等，他们联合或孤立对包括胃癌在内的消化道肿瘤的进程及后续化学治疗的疗效起着重要的作用，也是肿瘤多药耐药的研究高地[3，9]。
　　近年来随着中医肿瘤学的深入发展，中医药对肿瘤多药耐药的调控及影响作用已得到了公认，并转化为临床实践取得了较好的疗效[10]。姜黄是一种具有历史药用价值的中草药，具有行气破淤、通经止痛的功效。而姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种酚类色素，具有抗氧化、促凋亡、化疗增敏、抗血管生成、抗肿瘤等生物活性，可直接或间接地影响多药耐药的进程，临床及基础研究均提示其联合化疗药物在抗肿瘤治疗中已取得了正面效果[11]。目前寻求高效、低毒的逆转多药耐药的方法已成为研究的热点。实际上引起肿瘤多药耐药的机制比较复杂，但中药以资源丰富、含有多种逆转多药耐药的活性成分、作用靶点多，而引起了广泛关注。特别是近年来以姜黄素为代表的中药提取物的相关研究更是取得了突破性的进展。姜黄素具有抗癌谱广、毒副作用小等优点，可从凋亡、干扰多药耐药、增强化疗效果、影响滋养血管形成等多角度抗肿瘤，自1985年起就被相关研究揭示可抑制食管癌、胃癌、肝癌等相关细胞系[12-14]，同时已被美国国立肿瘤研究所列为肿瘤第三代化学预防剂[15]。但姜黄素对多药耐药作用的机制仍不完全明确，特别是肿瘤发展各阶段可直接进行微观干预的信号通路、蛋白等角度研究较为稀少，不利于其广泛的临床应用及推广。
　　正是基于上述原因本研究通过探讨姜黄素抑制人胃癌SGC7901/ADR细胞增殖情况以及过程中与多药耐药相关因子P170、GST-π表达规律的相关性，本研究在一定程度上揭示了姜黄素对胃癌多药耐药的抑制作用，既姜黄素的浓度及作用时间抑制SGC7901/ADR细胞株的增殖，差异具有统计学意义;随姜黄素浓度升高GST-π阳性表达率均出现下降趋势，但差异无统计学意义;而与P170则无直接关联性，这可能与实验样本较少及各细胞株独特性有关，待进一步深入研究。
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　　（收稿日期：2019-10-28）
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