新版《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》中临床实验室检测部分更新内容解读

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　　摘 要 人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus， HIV）感染是一个严重的医学和社会学问题。HIV感染的临床症状不典型，确诊依赖于实验室检测。《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》（WS 293—2019）已正式颁布，其提升了HIV RNA检测的地位，强调HIV核酸定性或定量检测结果也可作为HIV感染的诊断依据。本文主要就新版《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》中临床实验室检测部分的更新内容进行解读，同时对HIV感染的分子诊断相关研究进展作一概要介绍。
　　关键词 人类免疫缺陷病毒感染 HIV RNA检测 分子诊断
　　中图分类号：R512.91； R446 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2020）11-0017-04
　　Interpretation of updated content of the clinical laboratory test of new Diagnosis of AIDS and HIV Infection*
　　ZHU Zhaoqin**
　　（Department of Clinical Laboratory， Shanghai Public Health Clinical Center， Shanghai 201508， China）
　　ABSTRACT Human immunodeficiency virus （HIV） infection is a serious medical and sociological problem. The symptoms of HIV infection are not typical and its diagnosis depends on laboratory test. The Diagnosis of AIDS and HIV Infection （WS 293-2019） has been officially promulgated， which has promoted the status of HIV RNA detection and emphasized that qualitative or quantitative detection of HIV nucleic acid can be also used as the basis for its diagnosis. This article mainly interprets the updated content of the clinical laboratory test in new version of Diagnosis of AIDS and HIV Infection and meanwhile the research progress of molecular diagnosis for HIV infection is also outlined.
　　KEy WORDS human immunodeficiency virus infection； HIV RNA detection； molecular diagnosis
　　人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus， HIV）即艾滋病病毒感染是全球主要公共卫生问题之一。但HIV感染的临床症状不典型，确诊依赖于实验室检测，包括HIV抗体、p24抗原和核酸检测，其中HIV核酸检测即HIV RNA检测（很少应用HIV DNA检测）。
　　由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心牵头并联合我国11家艾滋病防治单位共同修订的《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》（WS 293—2019）[1]已正式颁布，其提升了HIV RNA检测的地位，强调HIV核酸定性或定量检测结果也可作为HIV感染的诊断依据。新版诊断标准的实施将进一步推动我国艾滋病诊断、治疗和防控工作，更好地服务于我国艾滋病患者。本文主要就新版诊断标准中临床实验室检测部分的更新内容进行解读，同时对HIV感染的分子诊断相关研究进展作一概要介绍。
　　1 新版诊断标准的主要修订内容
　　新版诊断标准在主要跟踪2008年版《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》颁布后全球及我国艾滋病防治工作进展[2-3]的基础上，有针对性地对我国HIV感染的诊断方法进行了扩充，同时对艾滋病临床分期作了调整，以使我国艾滋病防控人员、尤其是基层医疗卫生人员能更快捷、更方便地诊治HIV感染和艾滋病患者。
　　新版诊断标准全面纳入了HIV核酸检测，其主要修订内容包括：将HIV核酸检测的诊断范围从既往的儿童扩充到所有人群的HIV感染诊断；将HIV核酸检测的性质从既往用于诊断的定性检测扩充到也可用于临床治疗过程中所需大量应用的定量检测。新版诊断标准为保证HIV核酸定量检测的准确性，还根据我国试点工作数据，将其阈值设定为5 000 copies/ml；同时，对HIV感染和艾滋病的临床分期作了简化，从既往的3大期5小期调整为3期，即HIV感染早期、中期和晚期（艾滋病期）。根据新修订的《全国艾滋病检测技术规范》，依据HIV核酸检测结果作出HIV感染判定时应以所用试剂厂家的标准为主。
　　此外，新版诊断标准亦对正文进行了简化和更新，包括将2008年版中各期HIV感染患者的症状和临床表现列作为附录B。
　　2 以蛋白质免疫印迹（Western blot， WB）试验作为HIV感染的最终确认试验有较大的局限性
　　HIV相关的实验室检测主要包括HIV抗体检测、HIV核酸（定性和定量）检测、CD4+ T淋巴细胞计数检测和HIV耐药检测等，其中HIV-1/2抗体检测为HIV感染诊断的金标准方法，HIV核酸（定性和定量）检测也用于HIV感染诊断；HIV核酸定量（病毒载量）和CD4+ T淋巴细胞计数检测结果是判断HIV感染患者疾病进展、治疗效果和预后的两项重要指标值；HIV耐药检测结果则可用于指导高效抗反转录病毒治疗方案的选择和更换[2-3]。 　　我国当前仍倚重HIV抗体检测来诊断HIV感染，具体诊断策略也不同于美国等国。我国医院或其他检测机构在HIV“初筛”试验阳性后，需将样本送至疾病预防控制中心，由后者进行WB试验作为确认试验，而初筛的医院或机构并不具有出具HIV阳性报告单的资质。初筛试验须有较高的敏感性，目前国内应用的是可同时检测HIV-1抗体、HIV-2抗体和HIV p24抗原的第四代试剂，大大缩减了检测“窗口期”。确认试验国内应用WB试验，阳性判定标准为至少出现2条env带（gp41和gp160/gp120）或至少1条env带和p24带同时出现。 WB试验检测的也是HIV抗体，但与初筛试验相比，其特异性较高，能对初筛出的可疑样本给出一个确定结果。
　　WB试验检测HIV抗体的灵敏度较化学发光技术低。随着应用化学发光技术的新一代灵敏的免疫检验试剂以及以实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）为代表的核酸扩增技术的发展和成熟，WB试验灵敏度低的缺陷得到弥补。临床上使用的一些第三、四代HIV免疫检验试剂的低值阳性实为假阳性。如对HIV感染的低危人群，使用雅培公司Architect HIV combo试剂（属第四代试剂）检验结果为低值阳性（S/Co值1.00 ～ 15.00）的均是假阳性[4]。而对不少这样初筛结果的样本，WB试验结果常为不确定。因此，HIV抗体检测容易导致出现诊断困局，我们往往无法分辨低值阳性结果究竟是检验试剂特异性欠佳造成的假阳性还是被测者体内确实存在微量的HIV抗体，即使再进行WB试验，结果也常是不确定，仍需通过检测HIV的核酸和（或）抗原来帮助确诊。
　　此外，第四、五代化学发光试剂可同时检测HIV p24抗原和病毒特异性免疫球蛋白G、M抗体，而WB试验一般只能检测免疫球蛋白G抗体，会延长检测窗口期，造成HIV急性感染患者的漏诊。WB试验还有操作复杂、耗时长和判定结果较为主观的缺陷。2014年美国疾病预防控制中心更新了HIV检測结果报告导则[5]，要求联合使用HIV抗原和抗体检测试剂、能够区分HIV-1和HIV-2抗体的诊断试剂以及HIV-1核酸定性诊断试剂，以提高对HIV-1急性感染和HIV-2的检出效能，同时减少需予随访的不确定结果、缩短诊断时间，其流程图中也以HIV-1/2抗体鉴别试验（使用快速试剂）替代了传统的WB试验。
　　3 对HIV RNA检测设定诊断阈值存在争议
　　2018年我国更新了艾滋病诊疗指南，其中突出的一点就是强调了HIV RNA检测在HIV感染诊治方面的重要性，指出HIV核酸定性或定量检测也可作为HIV感染的诊断依据，尤其是在WB试验结果为不确定时及在早期明确HIV感染上，鼓励医院积极开展HIV核酸检测和检测报告结果咨询[2-3]。
　　在进行HIV核酸检测时，应使用已在国家药政部门注册的试剂，并严格按照其说明书操作。HIV核酸定性检测结果为有反应性时报告本次检测核酸阳性，检测结果为无反应性时报告本次检测核酸阴性。HIV核酸定量检测须严格按照实验室标准操作程序进行并以试剂盒说明书中的结果判定标准来作结果判定。《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》（WS 293—2019）继续沿用了2008年版《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》中HIV RNA检测的诊断阈值。当样本的HIV RNA检测值小于试剂盒所规定的线性范围下限时，报告低于检测限；当检测值>5 000 copies/ml时，报告具体检测值。在检测值≤5 000 copies/ml时，应尽量再次采样、检测，如检测值>5 000 copies/ml，报告具体检测值；如检测值≤5 000 copies/ml，也报告具体检测值，但需同时结合受试者的临床表现、流行病学史、CD4+ T淋巴细胞计数检测值或HIV抗体随访检测结果进行综合诊断。
　　对HIV RNA检测设定诊断阈值存在争议。美国相关临床指南[5]未设定HIV RNA检测的诊断阈值，其建议结果阳性即可诊断为HIV感染。欧洲HIV检测指南[6]则指出，当HIV RNA检测值<1 000 copies/ml时，需结合其他指标值进行综合分析，这可能是出于对检测污染的顾虑。易出现检测污染的试剂为基于信号级联扩增原理进行检测的分支DNA试剂和基于PCR产物杂交原理进行检测的Amplicor试剂。使用开放性操作的试剂检测HIV RNA，气溶胶污染的风险较大，且假阳性的病毒载量可至这些试剂的检出限值附近。
　　引入HIV RNA检测可帮助解决因WB试验结果为不确定而延迟HIV感染诊断和治疗的问题。HIV RNA检测已有国际标准品以保证检测质量，基于实时荧光定量PCR技术的检验试剂也很“成熟”。现今HIV RNA检验试剂多为基于实时荧光定量PCR技术的产品，其可全程实时检测扩增信号，不需对PCR产物开盖检测，灵敏度得到很大的提高，检出限值一般都≤50 copies/ml，且气溶胶污染风险也小。HIV RNA检测得到低病毒载量结果是可能的。例如，在暴露于HIV后极早期和采取HIV暴露前或后预防治疗失败的被测者，由于HIV在体内刚开始复制，都可能会有一个短暂的低病毒载量期。从检验方法角度分析，还可能出现因检验试剂性能缺陷（如HIV突变引起的引物或探针不完全匹配；HIV RNA未完全提纯，混有抑制物；PCR体系效率低下等）所致低病毒载量的假象。HIV RNA低值阳性在确诊HIV感染时仍有参考价值。目前市售的HIV RNA检验试剂的灵敏度都可满足低病毒载量的检测要求。
　　4 HIV RNA检验试剂应能覆盖针对所有基因型和突变HIV的引物和探针
　　HIV具有高度变异性。德国红十字血液中心曾报告，在3年合计270多万名自愿献血者中，经血清学方法检测发现有4名献血者感染了HIV，但使用HIV RNA检测的结果却都是阴性[7]。分析显示，其中2例样本是因使用检验试剂扩增的靶片段（5’-LTR区）出现了碱基缺失或突变，从而影响了引物和探针与HIV基因的结合，导致某些品牌检验试剂的HIV RNA检测结果偏低甚至漏检。因此，德国Paul-Ehrlich研究所要求从2015年开始，所有市售的HIV RNA检验试剂都应保证至少能扩增HIV基因的2个片段，以规避单一片段突变造成的漏检风险。 　　不能忽视因检验试剂性能缺陷造成的HIV RNA检测结果偏低的问题。低病毒载量的样本的阳性预测价值不一定就低，因为这种结果可能是由检验试剂的局限所致。众所周知，HIV RNA的变异性很大，使用针对HIV基因单一片段（如5’-LTR区）设计引物和探针的检验试剂检测可能会得到低病毒载量结果甚至漏检。需设计能覆盖所有基因型和突变HIV的引物和探针，其中5’-LTR、gag和pol区是引物和探针最常针对的位置。
　　5 不再设置HIV感染免费治疗的CD4+ T淋巴细胞计数“门槛”
　　对HIV感染和艾滋病发现越早、治疗越早，越有利于延长患者生命，同时减少其傳染性，这是艾滋病防控的关键。该策略对HIV感染者尤为重要，因为及早治疗甚至可能阻断病毒基因整合入人的基因组，避免形成稳定的病毒库，感染者受益极大。我国原规定，能享受免费治疗的HIV感染和艾滋病患者的CD4+ T淋巴细胞计数应<500/μl，但现已不再设置此“门槛”，而要求发现即治疗，确诊即治疗。这一新的治疗理念应予大力宣传，尤其是应在HIV感染高危人群中广泛宣传。
　　新版《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》第5章诊断原则中提到，HIV感染和艾滋病的诊断应以实验室检测结果为依据，结合被测者的临床表现并参考其流行病学资料进行综合判定。HIV抗体和病原学检测是确诊HIV感染的依据；流行病学史是诊断急性期和婴幼儿HIV感染的重要参考；CD4+ T淋巴细胞计数和临床表现是HIV感染分期的主要依据；艾滋病指征性疾病是艾滋病诊断的重要依据。没有一种检验方法或指标值能100%确诊某种疾病，紧密结合被测者的临床表现才能作出正确的诊断。
　　6 结语
　　我国HIV感染检测报告有一定的流程，谨慎报告阳性结果无可厚非。对极早期、HIV RNA低值阳性的HIV感染患者及早治疗，他们的临床获益最大。此外，应推广HIV RNA检测，以逐渐替代WB试验。
　　参考文献
　　[1] 中华人民共和国国家卫生健康委员会. 艾滋病和艾滋病病毒感染诊断（WS 293—2019）[EB/OL]. [2020-01-03]. http：//www.doc88.com/p-1166424074434.html.
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　　[3] 沈银忠. 《中国艾滋病诊疗指南（2018版）》解读[J]. 传染病信息， 2019， 32（1）： 16-20.
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