不同分子量双参多糖抗氧化活性研究

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　　【摘 要】 目的：对不同分子量双参多糖的抗氧化活性研究。方法：双参经水提醇沉法、sevag法脱蛋白、大孔吸附树脂脱色素得粗多糖，采用40%、60%、80%乙醇分级醇沉得到三个不同分子量的双参多糖TGPA、TGPB和TGPC，利用HPGPC色谱分析三个不同醇沉部位的双参多糖分子量。采用DPPH自由基和超氧阴离子自由基体系对其进行抗氧化活性评价。结果：TGP（A-C）分子量范围在1600～2000 KDa、630～2000 KDa 和230～2000 KDa。TGPA主要的分子量为2000 KDa、TGPB主要分子量为691830KDa、TGPC主要分子量为575439KDa。不同分子量的双参多糖体外抗氧化活性均呈浓度浓度依赖性，其中分子量小的双参多糖具有较高的清除作用。结论：双参多糖具有一定的抗氧化作用，为其进一步均一多糖的分离纯化、结构表征和活性探索奠定基础。
　　 【关键词】 双参;多糖;抗氧化
　　 【中图分类号】R284 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2020）8-0034-03
　　Study on the Antioxidant Activity of Polysaccharides from  Triplostegia glandulifera  with Different Molecular Weight
　　LI Caiyi XIE Wenjing WANG Fusheng*
　　Collage of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali 671000，China
　　Abstract：Objective To study the polysaccharides of  Triplostegia glandulifera  with different molecular weights.Methods The crude polysaccharides were obtained from  Triplostegia glandulifera  by water extraction and alcohol precipitation method，sevag method，decolorization by macroporous adsorption resin，and 40%，60%，and 80% ethanol fractionation and alcohol precipitation to obtain three  Triplostegia glandulifera  polysaccharides with different molecular weights，TGPA，TGPB and TGPC，HPGPC chromatography was used to analyze the molecular weight of  Triplostegia glandulifera  polysaccharides in three different alcohol precipitation sites.The DPPH and superoxide anion system were used to evaluate their antioxidant activity.Results The molecular weights of three different alcohol precipitation sites were in the range of 1600～2000 KDa、630～2000 KDa and 230～2000 KDa..The main molecular weight of TGPA is 2000 KDa，the main molecular weight of TGPB is 691830 KDa，and the main molecular weight of TGPC is 575439 KDa.The anti-oxidant activity of  Triplostegia glandulifera  polysaccharides with different molecular weights was concentration dependent in vitro，and the  Triplostegia glandulifera  polysaccharides with small molecular weights had a higher clearance effect.Conclusion  Triplostegia glandulifera  polysaccharides has certain antioxidant effects，which lays a foundation for its further structural characterization and activity exploration.
　　Key words： Triplostegia glandulifera ; Polysaccharide;Antioxidant
　　
　　多糖是由10個及以上的单糖通过糖苷键连接而成的糖，属于高分子化合物。研究表明许多植物多糖具有免疫调节、降血脂、降血糖、抗肿瘤等生物活性[1]。双参（ Triplostegia glandulifera ）为川续断科双参属植物，又称萝卜参、对对参、童子参、肚拉、土洋参和一支蒿等，主要产于云南、西藏、四川等地[2-3]，课题组前期对双参小分子化合物进行了系列研究，尚未见文献报道双参多糖的研究。本课题旨在研究双参不同分子量双参多糖的抗氧化活性，以期为进一步研究双参多糖结构与活性提供参考依据。 　　1 仪器与材料
　　1.1 仪器 HPLC-1260型高效液相色谱仪;FY135型中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）;湘立离心机TD5A-WS（湖南湘立科学仪器有限公司）;Shodex OHpak 804色谱柱（300 mm×7.5 mm）。
　　1.2 材料 右旋糖苷系列标准品180 Da（批號：140637-201203）、2500 Da（批号：140638-201203）、4600 Da（批号：140639-201203）、7100 Da（批号：140640-201203）、10000 Da（批号：140641-201203）、21400 Da（批号：140642-201203）、41100 Da（批号：140643-201203）、84400 Da（批号：140644-201203）、133800 Da（批号：140645-201203）、2000 kDa（批号：140646-201203）均购自中国食品药品检定研究院;1 mol/L Tis-Hcl缓冲液（批号：20190219，北京索莱宝公司）、DPPH（1，1-二苯基-2-苦基肼自由基，批号：ZZZQK-EE，梯希爱化成工业发展有限公司），水杨酸、H2O2、邻苯三酚、VC均购自国药集团化学试剂有限公司。
　　 双参植物于2017年10月采自于云南省大理州云龙县五宝山，经大理大学段宝忠教授鉴定为川续断科双参属植物双参（ Triplostegia glandulifera  Wall.）的地下根，植物样本（编号：WFS-20171017）存放于大理大学药学与化学学院王福生教授课题组。
　　2 方法
　　 2.1 提取与分离 取双参块根进行干燥（50 ℃恒温干燥），利用粉碎机粉碎双参块根至80目筛制成干粉备用。称取干燥的双参粉末1 Kg，加入95%乙醇2 L冷浸过夜，弃上清，滤出药渣，加入2 L蒸馏水置于索式提取器中加热回流，每次2 h，此操作重复三次，合并续滤液，经减压浓缩后利用Sevag法去除蛋白，萃取后上层为蛋白质层，弃去，浓缩下层滤液成浸膏200 g溶解至蒸馏水中通过AB-8大孔吸附树脂柱层析脱去色素等小分子杂质，依次采用蒸馏水、30%甲醇-水和60%甲醇-水洗脱剂洗脱。以苯酚硫酸法监测合并具有同一峰型的洗脱成分即得双参粗多糖，将双参粗多糖减压浓缩至600 mL。采用分步醇沉的方法，依次加入无水乙醇至醇沉浓度分别为 40%，60%和80%，置4 ℃冰箱内过夜。3500 rpm离心10 min，沉淀冷冻干燥分别得不同分子量的双参多糖TGPA、TGPB和TGPC。
　　2.2 不同分子量双参多糖相对分子质量测定
　　 2.2.1 色谱条件 色谱柱：Shodex OHpak 804（300 mm×7.5 mm）;流动相：超纯水;浓度：标准品及样品质量浓度均为1 mg/mL;进样量：10 μL;体积流量：0.5 mL/min;柱箱温度：35℃;氮气流速：1.3 mL/min，蒸发光检测器蒸发温度：55℃;雾化温度：45℃。
　　 2.2.2 含量测定 将右旋糖酐标准品180、2500、4600、7100、10000、21400、41100、84400、133800 Da、2000 KDa依次进样，测定保留时间。以相对分子质量对数（log Mw）为纵坐标保留时间（tR）为横坐标绘制标准曲线。根据线性回归方程计算样品的Mw。
　　2.3 清除DPPH活性作用的测定 精密称取DPPH粉末0.0128 g于50 mL容量瓶加入无水甲醇定容至刻度线，配制成0.65 mmol/L的DPPH-甲醇溶液，将多糖溶液配制成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的样品溶液，向96孔板中加入50 μL不同浓度的样品溶液，每个样品浓度设5个复孔，再向各孔中加入150 μL DPPH甲醇溶液，以相同浓度的Vc溶液作阳性对照组，蒸馏水作空白对照，于室温黑暗处放置30 min后，酶标仪517 nm波长处测定吸光度值。根据公式1计算TGPA、TGPB和TGPC的清除率。
　　 公式1=（Ablank-Asample）/Ablank
　　2.4 清除超氧阴离子作用测定 按照 Kao 等方法[4]，将多糖溶液配制成浓度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的样品溶液。取10 mL试管加入1 mL多糖溶液，依次向试管中加入0.05 mol/L Tis-HCl（pH=8.2）4.5 mL，25 mmol/L邻苯三酚0.4 mL，于25℃水浴反应5 min后，加入8 mmol/L HCl 1 mL终止反应，以相同浓度的Vc作阳性对照组，蒸馏水作空白对照组。于299 nm处测定吸光度值，根据公式2计算不同醇沉浓度多糖对超氧阴离子的清除率。
　　 公式2=（Ablank-Asample）/Ablank
　　3 结果
　　3.1 相对分子量的测定 根据系列不同分子量系列的标准品，按照相对分子质量对数（log Mw）为纵坐标;保留时间（tR）为横坐标绘制标准曲线，得曲线方程式为： y=-0.3491x+9.9531，R2=0.994 。根据高效凝胶出峰时间（图2所示）可知TGPA分子量范围为1600～2000 KDa ;TGPB分子量范围为630～2000 KDa ;TPGC分子量范围为230～2000 KDa。其中TGPA主要的分子量为2000 KDa、TGPB主要为 691830KDa、 TGPC主要为575439KDa。如图1所示。
　　3.2 抗氧化活性 由图2可知，TGP-（A-C） 对DPPH和超氧阴离子的清除作用结果显示：在不同浓度下TGPA、TGPB和TGPC均对DPPH自由基和超氧阴离子均有一定的清除作用，其清除能力呈浓度依赖性。不同分子量的双参多糖对DPPH的清除作用效果没有太大的差距。而对于超氧阴离子的清除作用中，TGPC清除超氧阴离子的效果最为显著。TGPA和TGPB对超氧阴离子的清除也有一定的效果，其中TGPA的清除效果最弱。 　　4 结论
　　 近年来，随着多糖研究的不断深入，发现植物多糖具有很多良好的生物活性。例如抗肿瘤、抗疲劳、降血糖等生物活性。而对双参多糖的研究尚未见其报道。本实验将双参多糖经水提醇沉、Sevag法脱蛋白、AB-8大孔吸附树脂柱分离，分步醇沉得到不同分子量的双参多糖。以蒸馏水作流动相，蒸发光检测器检测，采用不同分子量标准品建立标准曲线，从而确定双参多糖的分子量。理论上，分步醇沉中，低体积分数的乙醇溶液沉淀下来的双参多糖相对分子质量越大，而上清液部分则是相对分子质量小的双参多糖或寡糖，随着醇沉的次数增多，沉淀体积越来越少，离心后依旧存在少量沉淀部分存在上清液中，导致分子量存在交叉。由于交叉存在量很少可忽略不计。综合药理活性结果表明：不同分子量段的双参多糖均对DPPH体系和超氧阴离子体系具有清除作用，TGPA、TGPB和TGPC对DPPH的清除作用远远低于Vc的清除作用，而对超氧阴离子的清除作用中可以看出TGPC的清除作用远大于TGPA和TGPB双参多糖，当浓度达到1 mg/mL时清除超氧阴离子的作用與抗坏血酸作用相当。从而可以进一步推测在TGPC双参多糖具有更好的清除作用，继而为双参均一多糖的分离纯化、结构表征、药理活性及其作用机制的进一步研究提供了基础材料。
　　参考文献
　　[1]徐翠莲，杜林洳.多糖的提取、分离、纯化及分析鉴定方法研究[J].河南科学，2009，27（12）：1524-1526.
　　[2]何银堂，胡作亮.本草名释与传说[M].北京：中国中医药出版社，1998.
　　[3]大理白族自治州人民政府.大理中药资源志[M].昆明：云南民族出版社，1991.
　　[4]KAO T H，CHEN B H.Functional components in soybean cake and their effects on antioxidant activity[J].J Agric Food Chem，2006，54（20）： 7544-7555.
　　（收稿日期：2020-01-10 编辑：刘 斌）
　　基金项目：国家自然科学基金（31860098）。
　　作者简介：李彩艺（1994-），女，汉族，硕士研究生在读，研究方向为天然药物化学。E-mail： lcytianhua@163.com
　　通信作者：王福生（1965-），男，白族，博士，教授，研究方向为天然药物化学。E-mail： wfsyn@163.com
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