骨缺损修复中干细胞成骨分化调控因素研究进展

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　　[摘要] 干细胞因来源广泛、可自我更新、拥有多向分化潜能等优点，目前已广泛用于组织修复实验和临床研究，特别是在骨缺损修复中展现出良好的应用前景。在骨组织工程中，干细胞作为缺损修复支架的组成要素，为缺损修复提供细胞来源和活性基础，因此探究骨缺损修复中干细胞成骨分化的主要调控因素尤为重要。本文将从支架的材料组成、材料表面微观结构、空间宏观结构、外源性药物、体外刺激等因素综述骨组织工程中干细胞成骨分化调控因素、作用机理与研究进展，为骨缺损修复的基础研究与临床应用提供新思路。
　　[关键字] 骨缺损修复;干细胞;成骨分化;支架;刺激
　　[中图分类号] R318          [文獻标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）23-0186-07
　　Research progress of regulatory factors of osteogenic differentiation of stem cells in repairing bone defects
　　LI Lingrong1， 2 LIU Yumei1， 3 SHI Feng1， 2 CHEN Zhenyong1， 2
　　1.West China Normal University， Collaborative Innovation Center for Organization and Repair Materials Engineering Technology， Nanchong   637009， China; 2.School of Life Science， West China Normal University， Nanchong   637009， China; 3.School of Environmental Science and Engineering， West China Normal University， Nanchong   637009， China
　　[Abstract] Stem cells have been widely used in tissue repair experiments and clinical research specially showing good application prospects in bone defect repair， due to their advantages of wide source， self-renewal， and multi-directional differentiation potential. In bone tissue engineering， stem cells， as a component of defect repair scaffolds， provide cell source and active basis for defect repair. Therefore， it is particularly important to explore the main regulatory factors of stem cell osteogenic differentiation in bone defect repair. In this article， we will review the regulatory factors， mechanism and research progress of osteogenic differentiation of stem cells in bone tissue engineering from the factors such as the material composition of the scaffold， the microstructure of the surface of the material， the macroscopic structure of the space， the exogenous drugs， and in vitro stimulation. This provides a new idea for the basic research and clinical applications of bone defect repair.
　　[Key words] Bone defect repair; Stem cells; Osteogenic differentiation; Scaffold; Stimulation
　　因骨肿瘤疾病、交通意外创伤、人口老龄化等原因导致的骨缺损使临床对修复材料的需求巨大[1]。自体骨、异体骨和人工骨等材料被骨科医生用来修复骨缺损。自体骨由于其良好的骨诱导和骨整合能力，是骨移植的“金标准”，但自体骨供应有限，二次手术中易出现额外的失血量和潜在的并发症，使感染风险和手术并发症的机率上升，导致住院时间和康复时间延长;而异体骨作为自体骨的替代，本身的免疫原性可能会导致免疫排斥，还会造成延迟愈合和感染等并发症[2]。临床骨缺损修复材料需求不断增加和供应量的明显不足间矛盾，推动了利用骨组织工程技术研发人工骨材料的发展，为骨缺损修复提供替代方案[3]。
　　骨组织工程的核心三要素为生物支架、活性因子和种子细胞。其中，种子细胞是骨组织工程中具有生命活性的因素，一方面作为骨组织再生的细胞基础，为骨缺损修复提供细胞来源，分泌骨相关细胞外基质，加速骨愈合过程;另一方面作为骨组织再生过程中作用对象，受到支架、活性因子、外界刺激等因素调控，向成骨、成软骨等方向转化。干细胞因来源广泛、可自我更新、具有多向分化潜能等优势，成为骨组织工程最主要的种子细胞来源[4]。在骨组织工程中，作为种子细胞的干细胞主要通过增殖并分化为成骨细胞，分泌相关细胞外基质和活性因子为骨缺损修复提供活性来源和物质基础。近年来，如何诱导干细胞向成骨细胞分化，促进骨缺损修复是骨组织工程研究的热点之一[5]。利用骨组织工程技术修复骨缺损的过程中，干细胞的成骨分化不仅受到支架载体、成骨诱导因子等调控，而且会受到体内炎症细胞、破骨细胞等细胞间调节作用影响。此外，体外外加微振动、磁场等物理刺激被誉为骨组织工程的第四因素，也具有一定促进作用[6]。本文针对骨组织工程中干细胞成骨分化的诸多调控因素进行分类整理并探讨其影响机制。 　　1 生物支架
　　利用干细胞构建骨修复材料，需要适宜的转运载体。生物支架作为骨缺损填充的物理结构，一方面作为干细胞的载体，承载并保护干细胞植入患者缺损处，为干细胞的黏附生长提供适宜的空间结构，另一方面通过支架材料组成、支架表面微观结构和支架空间宏观孔隙等因素调控干细胞的分化。
　　1.1 支架材料组成
　　目前用于骨组织工程的生物支架材料主要包括金属、高分子和无机陶瓷。其中无机陶瓷材料，特别是磷酸钙陶瓷材料如羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）、磷酸三钙（Tricalcium phosphate，TCP）、双相磷酸钙（Biphasic calcium phosphate，BCP）等与体内骨无机成分近似受到广泛关注[7]。大量研究表明干细胞成骨分化受到支架材料化学特性的影响。首先，支架材料的表面电荷以静电作用力利于干细胞的表面黏附和富集，还促进体内骨相关生长因子的吸附，提高局部因子浓度，诱导材料表面黏附的干细胞的成骨分化[8];其次，支架材料降解，特别是磷酸钙材料产生的Ca2+、PO43-离子，一方面为骨重建提供无机离子，另一方面通过细胞的钙敏感受体、蛋白激酶C及细胞外信号调节激酶1/2等信号通路刺激其成骨分化[9]。
　　为增强材料的生物活性，可采用离子掺杂等手段将具有生物活性镁、钴、硼等离子引入磷酸钙材料内。活性离子在植入部位的缓慢释放可刺激干细胞分化。张芝祥等[10]将镁离子引入骨水泥体系中，发现镁的掺入未改变骨水泥的理化性能，且镁可促进细胞的增殖和成骨分化，利于骨组织修复。
　　1.2 支架自身硬度
　　由于材料性质差异，导致材料硬度有所不同。干细胞在其表面生长、增殖和成骨分化必然与材料间存在着生物-材料硬度作用[11]。Engler AJ等[12]通过将骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）培养于聚丙烯酰胺水凝胶表面，调节水凝胶交联情况，改变干细胞感受的硬度（25～40 kPa），在没有诱导因子的条件下发现，BMSCs在类骨质硬度环境中呈现与成骨细胞相似的多角形，并且成骨细胞标志分子Runt相关转录因子（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）表达水平上调，结果表明基底硬度对骨髓间充质干细胞成骨分化有一定调控作用。Xue R等[13]也通过类似实验，发现（40.0±3.6）kPa的硬基底上成骨分化相关基因碱性磷酸酶、胶原蛋白和Runx2的基因表达水平明显升高，进一步证实了基底硬度对BMSCs的成骨分化有一定调控作用。
　　1.3 生物支架表面微观结构
　　干细胞在支架内黏附、生长和成骨分化，首先是与生物支架的表面相接触。支架表面微观结构可为干细胞的黏附、生长提供特异性接触位点，在微纳米尺度范围内与单个或数个细胞直接接触，直接影响干细胞个体的成骨分化，最终影响整体骨修复材料的成骨效果[14]。通过生物支架表面构建微观结构，一方面可增加材料自身的比表面积，利于材料内有效离子溶出和促成骨生长因子吸附，促进干细胞成骨分化;另一方面改变细胞微观形状、微观受力等刺激，经信号通路传导至细胞内，影响干细胞成骨分化。生物支架表面微观结构主要包括微孔结构、粗糙度结构、微纳米结构和微图形结构。
　　1.3.1 微孔结构  天然骨组织内部分布众多微孔结构，研究者从仿生角度出发，在支架内部构建微孔结构以获得更优的骨修复效果。Anselme K等[14]发现大孔BCP支架中引入微孔结构，可以促进体内骨诱导效果，认为是微孔引起的毛细作用影响体内骨的生长。Polak SJ等[15]采用高分子海绵法为模板，采用不同粒径的BCP纳米颗粒浆料涂覆制备支架，然后在二次涂敷使调节BCP混合颗粒比例和烧结温度，可以构建出不同密度的微孔结构。成骨细胞的体外研究表明，具有微孔结构支架提高了细胞的扩散、增殖和分化的能力，并优选出最适宜的微孔直径范围为1～5 μm。Polak SJ等[15]发现材料表面微孔结构被溶液封闭时，对细胞黏附、增殖和分化的促进作用会减弱，且体内实验也表明封闭材料表面微孔结构会减弱其成骨效果。虽然微孔促进干细胞成骨分化和新骨形成的确切机制仍不明确，但可能的相关机制有以下几种[15，16]。首先，微孔可显著提高支架的比表面积，提高支架的渗透性，提供更多的蛋白吸附位点，促进支架的降解。其次，支架的表面粗糙度、表面自由能、表面电荷、化学功能等表面性质在干细胞的成骨分化中也起着重要作用。第三，微孔产生的毛细管力可将干细胞锚定在基质表面，使细胞变形并将其拉入比细胞更小的微孔中。适当的微孔率可促进干细胞的成骨分化，但过高会影响支架的力学性能[17]。宏孔与微孔结合对干细胞的分化具有协同促进作用，但现有制备工艺和方法难以在支架表面构建理想可控的微孔结构，是目前亟待解决的问题之一。
　　1.3.2 粗糙度结构  骨与植入支架成功融合与支架材料的表面粗糙度结构有很大的关系，支架材料表面粗糙结构可调节间充质干细胞的骨桥蛋白、骨钙素的基因表达，促进其成骨分化。Yang W等[18]用不同型号的砂纸打磨HA片表面，制得不同粗糙度表面，接种干细胞发现相比光滑表面，粗糙表面一方面促进干细胞的黏附和铺展，另一方面刺激相关信号通路促进干细胞成骨分化。Wu F等[19]发现材料表面粗糙度到纳米级别可影响材料表面的电荷分布，从而引起表面吸附的纤连蛋白构象改变，进而影响细胞的黏附程度和细胞因子的分泌。
　　1.3.3 微纳米结构  微纳米复合结构是一种通过模拟骨基质的三维结构促进干细胞成骨分化的生物材料特性。Xia L等[20]以α-TCP或HA支架为前驱体，利用钙磷溶液水热处理制作成表面纳米片、纳米棒和微纳米棒组合结构形貌修饰HA材料，研究以上支架材料對BMSCs成骨分化的影响，结果发现多级微纳米棒复合结构形貌相比其他两组纳米结构明显促进干细胞成骨分化。本课题组前期采用有机小分子和无机铜离子共同调控HA形貌，得到微纳米杂化结构，采用细胞学研究发现其可促进细胞成骨分化[21]。 　　1.3.4 微图形结构  根据仿生原理，研究者提出“接触引导”，即细胞接触到纳米到微米尺度的图案时，会根据图案结构特性调控自身沿着图案的方向定向生长。Kilian KA等[22]制备了与微米级的矩形、星形、五边形等图形，控制接种方法，并确保图形内单个干细胞黏附铺展，发现细胞随图形形状而改变自身形状，并伴随肌动蛋白等细胞骨架受力刺激细胞外调节蛋白激酶等信号通路影响细胞核内基因表达。Zhao C等[23]采用不同目数的尼龙网筛为模具得到表面微米尺寸可控的HA表面，与传统的表面平整的HA生物陶瓷相比，有序微米图案化结构的HA生物陶瓷具有更好的润湿性和更高的表面能，显著促进BMSCs的粘附、增殖和成骨分化，且图案化尺寸与细胞直径最为接近时促干细胞成骨分化能力最好。
　　1.4 生物支架空间宏观孔隙
　　干细胞在生物支架内生长，还会受到支架空间孔隙结构的影响。生物支架作为骨组织再生的场所，首先为细胞、血管、组织的新生和代谢提供三维空间位置和支撑，其次允许营养物质、氧气及代谢产物随体液和血液循环贯穿整个支架，为干细胞生命活动提供基础。总体来说，支架宏观孔隙结构可影响干细胞在体内所处的微环境，进而影响干细胞分化，最终影响其体内成骨情况[7]。生物支架空间宏观孔隙包括支架孔径、孔隙率、孔形态、贯通性等，但这些方面并不是独立存在的，而是相互影响、互有穿插。
　　1.4.1 孔径  支架孔径为细胞和血管向支架内部的长入提供空间和通道，一方面影响新生血管长入，改善营养物质传输，另一方面影响物质扩散，改变局部离子浓度及因子浓度，综合影响干细胞的成骨分化和体内骨的发育，然而最适宜的支架孔径尚无定论。刘楠等[24]将体外原代培养BMSCs细胞悬液接种于孔隙率近似、孔径范围不同（187～830 μm）的圆盘状多孔β-TCP材料中，发现不同孔径的多孔β-TCP对体外BMSCs的成骨分化均有促進作用，其中500～750 μm孔径的促进作用最为明显。为进一步探讨孔径因素对细胞成骨分化和骨再生的作用机制，本课题组前期采用孔隙率、贯通性近似但宏孔孔径不同的HA支架接种BMSCs，在体外构建动态灌流装置以模拟体内动态微循环环境内研究孔径对细胞分化影响，结果表明支架孔径差异可调整支架内微流场环境，从而使局部细胞感受的流体剪切力不同，通过细胞表面力学感受器传到至细胞内部，调节细胞分化差异[9]。
　　1.4.2 孔隙率和贯通性  孔隙率指支架内孔隙总体积所占支架总体积的比例，通常支架孔隙率增大，其贯通性有所改善。支架良好贯通结构是骨组织工程材料的前提，保证贯通性才能确保支架内外成骨的一致。孔隙率在干细胞成骨分化中同样扮演着重要角色，Ardeshirylajmi A等[25]利用明胶为制孔剂制备了10%、15%、20%三种孔隙率的壳聚糖支架，发现三种孔隙率的壳聚糖支架均促进干细胞的增殖和分化，但孔隙率较低的支架材料（10%）成骨标志物表达显著高于其他孔隙率和对照组，可更好地促进干细胞聚集释放钙沉积和成骨分化。推测是低孔隙率支架提高细胞密度，增加细胞间信号传递和细胞交流，促进干细胞成骨分化。但并不是说孔隙率越低越好，因为生物支架的孔隙为细胞的生长提供空间，孔隙率过低细胞无法长入支架内部，造成局部骨再生不足。
　　1.4.3 孔形态  当细胞在支架孔隙结构中黏附、铺展，直接接触细胞的平面铺展和空间折叠形态会受到依附的支架内壁形态限制和改变，进而通过生物级联作用向孔隙中央细胞和组织传递刺激信号。Chu TMG等[26]对比交叉形和辐射形两种孔形态的磷酸钙支架在体内成骨情况，结果表明支架孔隙形貌影响体内成骨分布。研究发现，支架孔形态差异对细胞影响主要是孔内壁的曲率半径差异导致细胞受力和细胞形态改变，影响细胞的分化性能[27]。传统制备方法中，支架的孔形态主要受到制备方法限制：模板法制备的支架孔形态取决于模板（如糖球/水凝胶球模板为球形孔隙[28]、盐颗粒为方形孔隙[29]），冻干法制备的支架孔形态取决于冻干参数[30]等。而3D打印技术在支架制备中的应用，极大的拓展了支架孔形态的样式和分布[31]。由于制备方法差异，对于最佳孔形态无统一标准。
　　2 活性药物
　　干细胞周围的微环境与干细胞的成骨分化密切相关。支架上负载活性药物，在缺损处具有缓控释效果，能够调节干细胞所处的微环境，影响干细胞的成骨分化。活性药物主要包括生长因子、外源性药物等。
　　2.1 生长因子
　　生物材料与生长因子结合已被证实是一种有效的方法用于骨组织修复与再生，局部应用生长因子在早期可促进干细胞成骨分化，但难以持续发挥其作用，故研究主要集中在新型缓释生长因子的支架材料。目前研究较多生长因子的包括：骨形成蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）家族、基质细胞源性趋化因子-1（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1）、成纤维细胞生长因子、转化生长因子等。其中，BMP-2是BMP家族研究最广泛，有明确诱导干细胞成骨分化作用的生长因子[32]。但生长因子属于蛋白质类药物，生产成本较高，稳定性较差，保存条件较为苛刻，在支架装载过程中容易变性失活，且外源性蛋白质对于细胞分子水平的调控机制未确切了解，无法精确控制，有导致免疫反应、无限增殖癌变等隐患。
　　2.2 外源性药物
　　生长因子属于蛋白质类药物，生产成本较高，稳定性较差，保存条件较为苛刻，且外源性蛋白质对于细胞分子水平的调控机制未确切了解，无法精确控制，有导致免疫反应、无限增殖癌变等隐患。故另有研究者从事其他类活性药物的应用研究，例如地塞米松、中药淫羊藿中提取的淫羊藿苷等。中药作为我国传统医学和文化的瑰宝，蕴含丰富的资源，其中有很多对骨修复有确切疗效药物亟待开发。现代药理学研究表明，淫羊藿中提取的黄酮成分淫羊藿苷具有雌性激素样作用，可促进成骨、保护心血管、抗炎抗病毒、抑菌抗氧化、延缓衰老、调节免疫功能等[33]。Xie Y等[34]通过将淫羊藿载入无机/有机复合的多孔支架内，发现载药支架通过对淫羊藿的局部缓控释促进成骨细胞成骨分化、抑制破骨细胞、促血管发生等功效，可用于骨缺损填充、股骨头坏死治疗。 　　近几年，多种药物协同作用诱导成骨引起了人们的广泛关注。Zhang B等[35]利用糖球模板法制备了类似于骨小梁结构的HA支架，利用交联的海藻酸钠将负载地塞米松和SDF-1的β-环糊精微球固定在HA表面，由此构建的支架可按需释放两种药物，SDF-1和地塞米松的协同作用加速促进干细胞的成骨分化，药物协同效果跟药物释放情况紧密相关。
　　3 体外刺激
　　骨骼作为人体力学支撑和保护结构，在日常活动中会受到力、振动等生物物理性外加作用的影响。细胞作为骨骼内重要组成，必然也承受相应的刺激影响。生物物理性刺激（包括振动刺激、载荷、电场或磁场等）作为一种有效促进骨缺损修复且经济、安全的物理辅助疗法，近年来引起许多学者广泛关注[6]。
　　3.1 振动刺激
　　振动刺激，特别是低振幅（小于50 μm）、低强度（1 g）、振动频率1～100 Hz的微振动刺激模拟生理运动状态，促进骨组织内部组织液的运动，具有良好的促进骨组织再生效果[36，37]。Halonen HT等[38]系统研究了垂直振动、水平振动与复合振动对干细胞的刺激效果，结果发现水平振动促进干细胞成骨分化，而垂直振动抑制干细胞的成骨分化。结合细胞内肌动蛋白和细胞核荧光图像分析结果，发现振动刺激通过肌动蛋白应力引起细胞核的形变，从而刺激干细胞分化差异。利用合成多孔支架修复体内骨缺损，结合振动刺激可加速新骨的形成和组织的融合[39]。
　　3.2 力学载荷刺激
　　目前，力学因素影响BMSCs成骨分化的调控机制是许多研究人员者深入研究的问题，但其调控机制仍未明确[40]。李晓亮等[41]通过对BMSCs加载不同大小机械离心力，探讨机械应力刺激对BMSCs成骨分化的影响。研究发现BMSCs在170～250 g间歇性机械离心力加载下碱性磷酸酶活性增高、細胞骨钙素和Runx2等成骨相关的基因的相对表达量明显上调，说明间歇性机械离心力大小对BMSCs的成骨分化有一定调控效果，但力学载荷需要控制在适宜范围内。Baumgartner W等[42]通过增加剪切力和额外的压缩应变对脂肪干细胞进行过高的机械刺激，发现反而会引起脂肪干细胞的成脂分化。
　　3.3 磁场刺激
　　脉冲电磁场作为一种物理刺激，具有穿透能力，应用方便，成骨作用是其最为熟知的生物学特性。Xia Y等[43]等开发出一种用于骨组织工程的新型磁性粒子-磷酸钙骨水泥复合支架材料，在支架上植入人牙髓干细胞，研究中度磁场条件下干细胞的增殖、成骨分化情况。研究结果发现磁场刺激条件增强了新型磁性离子-骨水泥的生物相容性，碱性磷酸酶活性更高，成骨标记基因的表达明显上调，与纯骨水泥对照和非磁性离子-骨水泥材料相比，磁性粒子的添加使大鼠下颌骨缺损的成骨活性明显高于对照组。现目前，认为脉冲磁场影响BMSCs成骨分化的调控机制主要与激活离子通道[44]、改变骨形态发生蛋白以及激活Wnt/β-catenin信号通路等有关[45]。
　　3.4 电刺激
　　20世纪50年代发现骨的生物电特性以来，电刺激疗法已被应用于临床，作为促进骨折愈合和增强脊柱融合的辅助手段[46]。电刺激可有效调节细胞和组织（包括骨组织）的生长行为，电刺激对BMSCs的成骨分化也有促进作用。但骨组织工程支架中，无机陶瓷或普通高分子材料导电性质欠佳，需要额外引入介质增加支架的导电能力。Ravikumar K等[47]通过在HA中加入CaTiO3，制备了导电HA支架，研究电刺激体外人体干细胞的分化性能。研究结果发现碱性磷酸酶、I型胶原和骨钙素在电刺激下表达明显上调。研究证实了导电HA-CaTiO3复合材料与间歇性电刺激能对hMSCs成骨分化具有积极影响。
　　4 小结
　　基于干细胞的骨组织工程技术是一项具有巨大应用前景的新兴技术，在骨缺损修复中促进干细胞定向成骨分化尤为重要。尽管对于干细胞的成骨分化已经取得一部分成果，但大多数分化研究局限于体外细胞培养或单一因素调控研究，缺乏综合因素在体内如何协同调控干细胞的成骨分化机制目尚未明确。干细胞在骨组织工程中应用依托支架材料，但研究集中于支架的单纯仿生制备却限制了骨缺损修复速率的提高，综合利用体内活性因子、药物或体外机械、磁场刺激等因素，协同提高干细胞成骨分化效果，加速骨再生能力具有巨大的研究和应用价值。
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　　（收稿日期：2020-05-08）
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