姜黄素类似物A13的抗炎活性研究

作者:未知

  [摘要] 目的 针对本课题组合成的姜黄素类似物A13,研究其抗炎活性。 方法 采用ELISA检测试剂盒检测脂多糖(LPS)诱导后1 h血清中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和6 h的白細胞介素-6(IL-6)释放量,观察A13三个剂量(10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg)作用后LPS诱导下小鼠炎症因子的释放量变化。采用苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining,HE染色)切片法比较空白对照Control组、LPS、LPS+A13三组小鼠肝脏和肺脏组织损伤情况。结果 LPS组小鼠血清中的TNF-α和IL-6较空白对照Control组均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),LPS诱导下小鼠急性炎症模型造模成功;LPS+A13三个剂量组的炎症因子TNF-α、IL-6释放量均较LPS组降低,分别抑制了45.8%、62.7%、73.1%和20.0%、26.4%、34.7%,差异有统计学意义(P<0.05);与空白对照Control组比较,LPS+A13三个剂量组TNF-α、IL-6释放量均有升高,差异有统计学意义(P<0.05)。A13三个剂量组间两两比较,TNF-α因子差异均有统计学意义(P<0.05);IL-6因子的10 mg/kg与20 mg/kg组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);IL-6因子的10 mg/kg与15 mg/kg、15 mg/kg与20 mg/kg组相互比较,差异无统计学意义(P>0.05)。HE染色结果显示A13三个剂量组均肺泡扩张不明显,肺泡腔内渗出物被吸收,肝脏组织结构破坏不明显,肺、肝脏组织结构基本恢复,接近于正常组织结构。 结论 姜黄素类似物A13能明显抑制LPS诱导的炎症因子TNF-α和IL-6的释放,可改善LPS诱导的肺和肝脏损伤,具有较强抗炎活性。
  [关键词] 脂多糖;姜黄素类似物;抗炎;炎症因子
  [中图分类号] R961.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701(2020)25-0037-05
  Study on anti-inflammatory activity of curcumin analog A13
  YU Congcong1   KONG Min2   WU Lingzhi1   LV Yangge1   SHEN Bin1
  1.Department of Pharmacy, Affiliated Hospital of Jiaxing University, Jiaxing First Hospital in Zhejiang Province, Jiaxing   314001, China; 2.Department of Anesthesiology, Affiliated Hospital of Jiaxing University, Jiaxing First Hospital in Zhejiang Province, Jiaxing   314001, China
  [Abstract] Objective To investigate the anti-inflammatory activity of curcumin analog A13 synthesized by our research group. Methods The tumor necrosis factor-α(TNF-α) in serum at 1 hour after induction of lipopolysaccharide(LPS) and interleukin-6(IL-6) at 6 hours after induction of LPS were detected by ELISA test kit. Changes in the release of inflammatory factors in mice after induction of lipopolysaccharide(LPS) at 3 action concentrations of A13 (10 mg/kg, 15 mg/kg and 20 mg/kg) were observed. The liver and lung tissue damage among the Control, LPS, LPS+A13 three groups of mice was compared by Hematoxylin-Eosin(HE) staining sectioning method. Results The serum levels of TNF-α and IL-6 in LPS groups of mice were higher than those of the control group, and the difference was statistically significant(P<0.05). The acute inflammation model of mice induced by LPS was successfully modeled. The inflammatory factors TNF-α and IL-6 released by the three dose groups of LPS+A13 were all lower than those of the LPS group, and the difference was statistically significant(P<0.05), inhibiting 45.8%, 62.7%, 73.1% and 20.0%, 26.4%, 34.7% respectively. Compared with that of the control group, the release of TNF-α and IL-6 of the three dose groups of LPS+A13 still increased, and the difference was statistically significant(P<0.05). The differences in TNF-α factor between the three A13 dose groups were statistically significant(P<0.05). There was a significant difference in IL-6 factor between 10 mg/kg and 20 mg/kg group(P<0.05). The difference in IL-6 factor between 10 mg/kg and 15 mg/kg group, between 15 mg/kg and 20 mg/kg groups were not significant(P>0.05). HE staining sections showed that the alveolar expansion in the A13 pretreatment groups were not obvious, the exudate in the alveolar cavity was absorbed, the liver tissue structure was not significantly damaged, and the lung and liver tissue structures basically recovered, close to normal tissue structures. Conclusion Curcumin analogue A13 can obviously inhibit the release of inflammatory factors TNF-α and IL-6 induced by LPS, and can improve LPS-induced lung and liver injury. It has strong anti-inflammatory activity.   [Key words] Lipopolysaccharide; Curcumin analogues; Anti-inflammatory; Inflammatory factors
  炎症是自身应对外来刺激产生的一种自我防护反应,多种疾病均会伴有炎症的发生,炎症反应是临床上常见的病理过程。无论慢性还是急性炎症反应,均与相应的疾病关系密切[1]。大量炎症因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)等的释放,会导致组织水肿,机体产生应激反应,甚至造成组织坏死[2-3]。姜黄素在抗炎、抗肿瘤、治疗糖尿病等方面均有作用[4-5],有报道提示姜黄素还具有抗氧化及调节脂质代谢等作用[6-7]。但是姜黄素的生物利用度低,不稳定,且不溶于水,无法制成针剂使用,这些缺陷大大阻碍了姜黄素的临床应用与发展[8]。
  本研究以姜黄素为原料,通过改造修饰姜黄素的结构,合成了姜黄素单羰基类似物A13(结构式见下文),具有良好的水溶性,本研究主要通过酶联免疫吸附剂测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE染色)研究A13抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导炎症因子释放的作用,探究其抗炎药理活性。
  1 资料与方法
  1.1 一般资料
  C57BL/6雄性健康小鼠80只,体重18~22 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号SCXK(浙)2018-0001。室温恒温,自由饮食饮水,食物和水按照标准配制与供给,实验前动物先适应3~5 d。本研究经我院伦理委员会审核批准。
  LPS(Sigma-aldrich,USA)、TNF-α ELISA检测试剂盒(Bioscience,SanDiego,CA)、IL-6 ELISA检测试剂盒(Bioscience,SanDiego,CA)、酶标仪(Tecan Co.,Swiss)、光学显微镜(Ti-s,日本尼康)。
  A13与HCl 1∶2制成盐酸水溶液(A13-HCl形式),将A13溶于水中,pH调至7.26,经0.22 μm微孔滤膜过滤后再用于一系列动物实验中。A13及其氯化物的结构见图1。
  1.2方法
  1.2.1 ELISA法检测血清中TNF-α和IL-6释放量 将C57BL/6雄性健康小鼠50只随机分为:①空白对照Control组;②LPS组;③LPS+A13 10 mg/kg组;④LPS+A13 15 mg/kg组;⑤LPS+A13 20 mg/kg组,每组10只。LPS+A13给药组分设三个剂量:10 mg/kg、15 mg/kg和20 mg/kg,给药组预先分三个剂量于尾静脉注射A13给药,注射15 min后,尾静脉注射200 μL LPS(10 mg/kg),LPS溶解于生理盐水中。空白对照组静脉注射同等体积的生理盐水,分别于1 h和6 h每组各处死5只。眼眶取血,2000 rpm/min,4℃离心10 min,取其上清液,IL-6(1 h)和TNF-α(6 h)因子测定分别通过ELISA试剂盒检测,最后由酶标仪在450 nm处测得OD值。
  1.2.2 肝脏和肺脏病理组织切片  将C57BL/6雄性健康小鼠30只随机分为:①空白对照Control组;②LPS组;③LPS+A13组,每组10只。尾静脉注射A13(15 mg/kg),15 min后,尾静脉注射LPS(10 mg/kg),2 d后,处死小鼠取肝脏和肺脏,用磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)洗涤后,固定于10%福尔马林中,石蜡包埋切片,HE染色,用光学显微镜观察肝脏和肺脏组织损伤程度。
  1.3 观察指标
  ELISA法检测并比较五组大鼠(空白对照Control组、LPS组、LPS+A13 10 mg/kg组、LPS+A13 15 mg/kg组、LPS+A13 20 mg/kg组)血清中炎症因子TNF-α和IL-6的释放量,并进一步观察A13给药组的三个剂量组间炎症因子释放量的关系;通过HE染色切片比较空白对照组、LPS组、LPS+A13三组小鼠的肺、肝脏组织损伤情况。
  1.4 统计学方法
  数据应用SPSS19.0统计学软件进行分析,计量资料用(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较方差齐者采用Bonferroni检验,方差不齐者采用Games-Howell检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 五组小鼠血清中TNF-α和IL-6释放量比较
  TNF-α是前炎症因子,发生于炎症早期,而IL-6发生于炎症中期,注射LPS 1 h和6 h后,血清中TNF-α(1 h)和IL-6(6 h)释放量分别上升。A13三个剂量预处理组TNF-α、IL-6释放量较LPS组均明显下降,对TNF-α释放量较LPS组分别抑制了45.8%、62.7%和73.1%,对IL-6释放量较LPS组分别抑制了20.0%、26.4%和34.7%。A13 20 mg/kg剂量对TNF-α、IL-6释放量抑制量最大,且三個剂量组随着剂量的增加,抑制量也随之增大,存在明显的剂量关系。
  TNF-α因子五组检测结果进行方差齐性检验,P=0.000,方差不齐,故采用Games-Howell检验进行两两比较,得出结果:LPS组较空白对照Control组明显升高,LPS+A13三个剂量组较LPS组均明显下降,15 mg/kg和20 mg/kg甚至下降至LPS组的1/2以下,LPS+A13三个剂量组较空白对照Control组有所升高,以上两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。A13三个剂量组间两两比较,10 mg/kg与15 mg/kg、15 mg/kg与20 mg/kg、10 mg/kg与20 mg/kg相互比较(P=0.001、P=0.003、P=0.000),差异均有统计学意义(P<0.05)。   IL-6因子五组检测结果进行方差齐性检验,P=0.530,方差齐,故采用Bonferroni检验进行两两比较,得出结果:LPS组较空白对照Control组明显升高,LPS+A13三个剂量组较LPS组均明显下降,LPS+A13三个剂量组较空白对照Control组有所升高,以上两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。A13三个剂量组间两两比较,10 mg/kg与20 mg/kg相互比较,P=0.039,差异有统计学意义(P<0.05),10 mg/kg与15 mg/kg、15 mg/kg与20 mg/kg相互比较(P=1.000、P=0.92),差异无统计学意义(P>0.05)。
  综上,五组小鼠血清中TNF-α和IL-6的LPS组较空白对照Control组均明显升高,LPS诱导下小鼠急性炎症模型造模成功;LPS+A13三个剂量组的炎症因子TNF-α、IL-6释放量均较LPS组降低,但较空白对照Control组还是有所升高的,差异均有统计学意义(P<0.05)。A13三个剂量组间两两比较:TNF-α因子的三个A13剂量组差异均有统计学意义(P<0.05);IL-6因子的10 mg/kg与20 mg/kg比较,差异均有统计学意义(P<0.05);IL-6因子的10 mg/kg与15 mg/kg、15 mg/kg与20 mg/kg相互比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
  2.2 三组小鼠肺、肝脏组织损伤情况比较
  肺組织切片显示,空白对照Control组:可见正常的肺组织结构,细支气管和各级肺泡结构清晰,可见肺泡间毛细血管。LPS组:正常肺组织结构有破坏,肺泡明显扩张,相邻肺泡融合成较大囊腔,肺泡间毛细血管扩张充血。LPS+A13组:肺组织结构逐渐恢复正常,肺泡扩张不明显,肺泡间毛细血管亦基本恢复正常,更接近于正常的肺组织结构。见封三图1。
  肝脏组织切片显示,空白对照Control组:可见正常肝脏组织结构,排列有序。LPS组:排列紊乱,间隙较大,组织结构被破坏。LPS+A13组:组织结构基本恢复,更接近于正常肝脏结构。见封三图2。
  LPS诱导后最明显的反应即急性肺损伤(Acute lung injury,ALI),严重者会发生肺泡腔出血、渗出等[9-11]。C57BL/6小鼠尾静脉注射LPS(10 mg/kg),2 d后会引起一定程度病理变化,发生组织损伤,如炎性细胞浸润、血管周围的水肿、肺泡腔出血等。除肺以外,肝脏组织结构也会受到一定程度的破坏与损伤,用A13(15 mg/kg)预处理能明显改善肝脏和肺脏的组织结构,抑制LPS诱导的肺泡扩张,抑制肺和肝脏组织排列紊乱等。
  3讨论
  姜黄素是姜科植物姜黄中的一种有效成分,其对炎症反应、肿瘤、风湿性关节炎等均有作用,因其有多种药理作用,现已成为研究热点[12-14]。尽管姜黄素对多种疾病均有疗效,但由于其不稳定和生物利用度不高等[15],临床使用受到限制。合成结构相似的姜黄素类似物,在疗效不减的同时,增加其稳定性和生物利用度,为研究开辟了新的方向。
  A13是本课题组自行设计并合成的新型抗炎化合物[16-17],具有明显优势,A13为水溶性化合物,可用于尾静脉注射给药,较之腹腔注射、灌胃等给药方式,药效发挥更好,生物利用度更高。在优化A13给药方式的基础上,本研究主要围绕其抗炎药理活性展开,LPS诱导小鼠急性炎症模型是公认成熟的模型,本研究中LPS造模也采用了尾静脉注射给药的方式,结果显示LPS组的TNF-α和IL-6较空白对照Control组均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05),造模成功。本研究基于前期预实验结果,在LPS诱导后1 h检测TNF-α,6 h检测IL-6,A13分设三个剂量组10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg,LPS剂量采用10 mg/kg。研究提示,LPS+A13三个剂量组小鼠血清中的TNF-α和IL-6较LPS组均明显下降,尤其是LPS+A13 15 mg/kg和20 mg/kg两个剂量组的TNF-α甚至下降至LPS组的1/2以下,差异均有统计学意义(P<0.05),LPS+A13三个剂量组分别抑制了TNF-α和IL-6释放量的45.8%、62.7%、73.1%和20.0%、26.4%、34.7%,且抑制量与A13给药剂量存在明显的剂量关系。A13三个剂量组间的TNF-α两两比较,10 mg/kg与15 mg/kg、15 mg/kg与20 mg/kg、10 mg/kg与20 mg/kg组相互比较,差异均有统计学意义(P<0.05),A13三个剂量中10 mg/kg剂量的抑制作用相对最弱,20 mg/kg剂量的抑制作用最强,A13抑制TNF-α释放与A13给药剂量存在明显的剂量关系。A13三个剂量组间的IL-6两两比较,10 mg/kg与20 mg/kg组相互比较,差异有统计学意义(P=0.039<0.05),10 mg/kg与15 mg/kg、15 mg/kg与20 mg/kg组间相互比较,差异无统计学意义(P=1.000、P=0.92>0.05)。尽管相邻两个剂量间无显著性差异,但10 mg/kg与20 mg/kg组差异有统计学意义,A13三个剂量中10 mg/kg剂量的抑制作用相对最弱,20 mg/kg剂量的抑制作用最强,A13抑制IL-6的释放与A13给药剂量存在明显的剂量关系。A13明显抑制了LPS诱导下炎症因子TNF-α和IL-6的释放,减缓炎症的发展进程,减轻炎症程度,达到抗炎效果。
  TNF-α是前炎症因子,发生于炎症早期,而IL-6发生于炎症中期,预实验结果得出:LPS作用1 h,TNF-α释放量达到最大,作用6 h,IL-6释放量达最大;A13前期实验结果提示其能明显抑制TNF-α和IL-6的释放。LPS+A13三个剂量组小鼠血清中的TNF-α和IL-6较空白对照组Control组均有所升高,差异均有统计学意义(P<0.05),A13虽有明显的抗炎作用,但与空白对照Control组相比,炎症因子的释放量仍有统计学差异,提示其对炎症的治疗作用需要一个过程,在LPS作用后的1 h和6 h这两个时间点,无法将急性炎症完全控制。本研究观察了HE染色的肺和肝脏的组织切片,LPS+A13组的肺组织较LPS组结构趋于正常,肺泡扩张不明显,肺泡间毛细血管亦基本恢复正常,更接近于正常的肺组织结构;LPS+A13组的肝脏组织较LPS组组织结构趋于正常,更接近于正常肝脏结构。A13可明显改善LPS诱导下肺和肝脏的组织损伤,其有较强的抗炎效果。有研究报道发现炎症基因的表达与细胞核转录因子(Nuclear transcription factor-κB, NF-κB)通路的上游激活有关[18-20],本研究提示在LPS诱导下,姜黄素类似物A13能明显抑制小鼠血清中炎症因子TNF-α和IL-6的释放,且抑制作用与A13给药剂量存在明显的剂量关系,A13可明显改善LPS诱导下肺和肝脏的组织损伤,其有较强的抗炎药理活性。   综上所述,本研究提示新型姜黄素类似物A13能够用于治疗炎症性疾病,在以后的研究中将会进一步对A13的抗炎机制进行研究,为抗炎药物的开发提供一定的研究基础。
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  (收稿日期:2020-04-30)
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