地诺单抗生物类似药的N-糖型优化

来源:用户上传      作者:殷龙 贾艳丽 姚月琴 张俭 谭小钉

　　摘 要 目的：使用糖型调节试剂优化地诺单抗（denosumab）生物类似药的N-糖基化修饰，使其主要糖型G0F和G1F的比例与地诺单抗高度类似。方法：利用单因素和DOE试验方法，考察不同浓度氯化锰、半乳糖及尿苷对地诺单抗生物类似药糖基化修饰的影响。结果：经过单因素试验、DOE分析及200 L细胞培养工艺放大，确定糖型调节剂氯化锰和半乳糖的最佳用量分别是150 mmol/L和35.56 mmol/L。结论：使用糖型调节剂氯化锰和半乳糖能有效调节地诺单抗生物类似药的糖基化修饰比例，可为其他单抗生物类似药生产工艺的优化提供借鉴。
　　关键词 生物类似药 糖基化 细胞培养
　　中图分类号：TQ460.62； TQ464.7 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2022）03-0077-05
　　N-glycosylation optimization for biosimilar denosumab
　　YIN Long， JIA Yanli， YAO Yueqin， ZHANG Jian， TAN Xiaoding
　　（Jiangsu Mabwell Health Pharmaceutical R&D Co.， Ltd.， Taizhou 225300， China）
　　ABSTRACT Objective： To optimize the N-glycosylation of denosumab biosimilar using some glycosylation reagents so as to make the proportion of G0F and G1F be highly similar to denosumab. Methods： The effects of the different concentrations of manganese chloride、galactose and uridine on the glycosylation of denosumab biosimilar were studied by single factor and DOE assays. Results： A preferred combination including manganese chloride 150 mmol/L， galactose 35.56 mmol/L was obtained by single factor test， DOE analysis and 200 L cell cultivation. Conclusion： The use of manganese chloride and galactose can effectively regulate the glycosylation modification ratio of denosumab biosimilar， which can provide a reference for the optimization of production process of the other mono-cloning antibody biosimilars.
　　KEy wORDS biosimilar； glycosylation； cell culture
　　抗体药物属于生物大分子药物，其生物功能的发挥离不开复杂的翻译后修饰。糖基化（glycosylation）作为抗体最重要的翻译后修饰，是指蛋白质或脂质在酶的作用下连接上糖链的过程，其对抗体的生物活性和体内代谢有着重要的作用[1]，不同的糖基化对抗体亲和力和体内代谢具有显著影响[2-4]。抗体药物中常见的糖型有岩藻糖（Fuc）、半乳糖（Gal）、唾液酸（Sia）和甘露糖（Man）修饰，不同比例的糖型修饰可影响抗体药物的稳定性、电荷异构、生物学活性等，如岩藻糖修饰影响单抗的抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）[5-6]；高甘露糖修饰可缩短药物的半衰期[7]；半乳糖修饰可提高抗体与补体的亲和力、增强补体依赖的细胞毒性（complement-dependent cytotoxicity，CDC）效应[8]。因此，糖基化修饰通常作为抗体药物生产过程中的关键质量属性（critical quality attributes，CQA）进行调控[9]。
　　地诺单抗糖基化形式为N-糖基化。N-糖基化是在内质网上由糖基转移酶催化、在内分泌蛋白和膜结合蛋白的天冬酰氨残基的氨基上结合寡糖的过程，寡糖中的乙酰葡萄糖与多肽链中天冬酰胺残基的酰胺氮连接形成N-连接糖蛋白。N-糖基化的位点是Asn-X-Thr/Ser（其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸）3个氨基酸残基组成的序列段[10-11]。单克隆抗体糖基化类型主要有G0、G0F、G1F、G2F、Man5等[1]，地诺单抗的糖基化类型以G0F和G1F为主，所占比例分别约为62%和20%；本研究中的单抗为地诺单抗生物类似药，其糖基化类型以G0F为主，所占比例约为80%。糖基化修饰的差异可能导致药物结合活性、半衰期等差异，从而影响药效，考虑到生物类似药用药的安全性，需将糖型优化至与地诺单抗高度类似。
　　糖型调节是生物药工艺研发过程中常遇到的工艺难题，影响单克隆抗体糖基化类型及比例的因素有很多，如细胞株、培养方式、培养参数控制等[1，12-16] ，在细胞株构建和筛选过程中，可通过基因改造等方式进行糖基化优化，如利用基因敲除降低r藻糖基化比例从而增强抗体的ADCC效应；在细胞培养工艺中可通过改变细胞培养过程中培养基的糖分、金属离子浓度等条件来改变蛋白质的糖基化类型及比例。细胞株构建虽然能从根本上决定糖型的类型与比例，但通过细胞株改造进行糖型调节耗时、耗力，并不适用于生物类似药的工艺优化。通过培养基成分的调节及控制参数优化是常见的优化方式，但细胞培养方式和控制参数对糖基化的影响通常是多因素交互作用的，在工艺开发过程中需要考虑工艺控制的可操作性和精确性；另外，在糖型优化过程中不仅需要选择合适的糖型调节试剂，还需要兼顾同一试剂对不同糖型的影响程度和影响趋势，以及产品本身的其它关键质量属性，如电荷异构体、蛋白纯度等；同时，不同培养规模条件下细胞生长环境的变化、不同反应器控制策略的差异导致细胞培养过程对糖型调节试剂需求有所差异，因此工艺放大过程可能带来的结果差异也需要特别关注。
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