HPLC法测定飞燕草中芦丁的含量
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作者: 徐力
[摘要] 目的：测定飞燕草中芦丁的含量，为飞燕草的质量控制提供依据。方法：本实验采用HPLC法测定芦丁含量，使用C18色谱柱，甲醇∶水∶冰醋酸（40∶60∶1）为流动相，检测波长为330 nm，柱温30℃，流速1.0 ml/min。结果：芦丁在0.912～4.560 μg与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 8，n=5），平均回收率为99.26%（RSD为1.72%，n=6）。结论：该法简便、稳定，可用于测定飞燕草中芦丁的含量和定性鉴别。
[关键词] 飞燕草；芦丁；HPLC法；质量控制
[中图分类号] R931.5 [文献标识码] C [文章编号] 1674-4721（2011）11（c）-049-02
Determination of rutin in Delphinium grandiflorum by HPLC
XU Li
Affiliated Hospital Pharmacy of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, Jilin Province, Changchun 130021, China
[Abstract] Objective: To determine the Delphinium grandiflorum of rutin, providing the basis for quality control for Delphinium grandiflorum. Methods: The experimental determination of rutin content by HPLC method, using C18 column, methanol∶water∶acetic acid (40∶60∶1) as mobile phase, detection wavelength of 330 nm, column temperature 30℃, flow rate 1.0 ml/min. Results: Rutin in the 0.912-4.560 μg and the peak area showed good linear relationship (r=0.999 8, n=5), the average recovery was 99.26% (RSD=1.72%, n=6). Conclusion: The method is simple, stable and can be used for determination of rutin in Delphinium grandiflorum and qualitative identification.
[Key words] Delphinium grandiflorum; Rutin; HPLC method; Quality control
飞燕草（Delphinium grandiflorum）为毛茛科翠雀属的多年生草本植物，又名大花飞燕草、千鸟草、翠雀、萝小花等，分布于我国各地。辛，苦，温，有毒，入肺、心、胃三经。具有止咳平喘，利水消肿，解痉止痛之功，主治喘息不得卧，水肿胀满，腹痛，风热牙痛，头虱等症[1]。主要含有生物碱、皂苷、黄酮等有效成分，经过前期试验，发现在东北地区所产飞燕草中含有一定量的芦丁，为了系统对飞燕草进行定性和定量研究，本文采用HPLC法测定飞燕草中的芦丁含量，为控制飞燕草药材质量提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；EP114C型电子分析天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]，TYS-80/28A型超声清洗机（保定市天一超能科技有限公司）。
1.2 试剂
芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号 100098-201112）；甲醇为色谱纯（美国Fisher公司）；其他试剂均为分析纯；飞燕草（采于吉林省磐石市，经长春中医药大学邓明鲁教授鉴定为毛茛科翠雀属的多年生草本植物飞燕草）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Agilent-C18（4.6 mm×250 mm）；甲醇∶水∶冰醋酸（40∶60∶1）为流动相；检测波长为330 nm；流速1 ml/min，柱温30℃[1]。
2.2对照品溶液的制备
精密称取芦丁对照品于10 ml容量瓶中，甲醇超声溶解，制成0.1 mg/ml的芦丁对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精确称取飞燕草全草500 g，加入乙醚5 000 ml浸泡3次，每次1.5 h，脱脂。残渣挥干乙醚，加80%乙醇5 000 ml，回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液。80℃下减压回收乙醇，浓缩液减压烘干（60℃），干品加蒸馏水1 000 ml超声溶解，过滤，滤液上HPD600大孔树脂，分别用蒸馏水、10%乙醇、80%乙醇梯度洗脱，收集80%乙醇洗脱液，减压回收乙醇（60℃），减压真空干燥（60℃），所得干品即为飞燕草总黄酮提取物，精密称取总黄酮干品20 mg于100 ml容量瓶中，80 ml甲醇超声溶解，放凉后加甲醇定容至刻度，微孔滤膜过滤，续滤液为供试品溶液[2-5]。
2.4 含量测定方法
精密吸取对照品与样品溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪中，测定峰面积，用外标法计算芦丁含量。
3 方法学考察
3.1 标准曲线的绘制
精密量取芦丁对照品溶液（0.456 mg/ml）1、2、3、4、5 ml于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，精密吸取上述溶液20 μl进样，并测定峰面积值，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并以进样量对峰面积值回归得回归为：Y=51 698X+68 325（r=0.999 8），含量在0.912～4.560 μg间呈良好的线性关系[6-8]。
3.2精密度试验
精密吸取对照品溶液20 μl注入液相色谱仪中，连续重复进样5次，记录峰面积，计算峰面积的RSD为0.198%，结果显示此方法测定芦丁含量精密度良好。
3.3 稳定性试验
取同一批次采集的飞燕草药材，按“2.3 供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，并分别于配制后0、4、8、12、16、20、24 h时进样并记录峰面积，所测峰面积结果显示样品在24 h内稳定性良好。
3.4 重复性试验
取同一批次采集的飞燕草药材，精密称取6份，按“2.3 供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，分别吸取20 μl注入高效液相色谱仪中，记录峰面积，计算峰面积RSD为0.456%，说明此方法测定芦丁含量重复性良好。
3.5 回收率试验
精密称取同一批次的飞燕草总黄酮提取物6份，每份2 g，研细，每份均加入芦丁对照品3.50 mg于100 ml容量瓶中，加甲醇80 ml超声溶解30 min，放冷后加甲醇定容至刻度，混匀后用0.45 μm微孔滤膜过滤，分别吸取续滤液20 μl，注入高效液相色谱仪中，测定峰面积。计算芦丁平均回收率为99.26%，相对标准偏差RSD为1.72%（n=6）。结果见表1。
表1 回收率试验（n=6）
3.6 样品测定
分别称取飞燕草药材100 g，共3批，按“2.3 供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，并测定含量，测定结果表明，样品芦丁平均含量为0.146%。
4 讨论
通过前期实验已经寻找出飞燕草总黄酮的有效提取方法，并且确定其中含有一定量的芦丁，在总黄酮的含量测定中，采用紫外分光光度法对其进行含量测定，从而控制总黄酮的含量，并取得满意效果。为进一步探讨飞燕草总黄酮的有效物质群，更加精确的定量控制飞燕草总黄酮的提取率，笔者又通过高效液相色谱法来考察飞燕草总黄酮中芦丁的含量，在参考2010版药典的基础上，摸索了飞燕草芦丁测定的液相条件，方法学考察表明，该方法简便、灵敏、可行、稳定，为飞燕草的进一步研究、开发、利用、质量控制奠定坚实的物质基础和理论依据。
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（收稿日期：2011-08-11）
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