天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料细胞相容性研究

来源:用户上传      作者: 唐晓军　归　来　吕晓迎

　　[摘要]目的：评价天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料(nature hydroxyaptite /chitosan composite，NHC )的细胞相容性。方法：人骨髓间充质干细胞诱导法培养成骨细胞，并鉴定。将材料与细胞体外进行复合培养，应用细胞增殖度，碱性磷酸酶和扫描电镜等对其细胞相容性进行评定。结果：骨髓间充质干细胞诱导的成骨细胞在复合材料表面粘附，生长良好，细胞增殖度无显著性差异(P＞0.05)，材料组与对照组之间碱性磷酸酶无显著性差异(P＞0.105)，扫描电镜观察发现24h后细胞生长良好，细胞连接紧密，有细胞外基质生成。说明本复合材料具有良好的细胞相容性。结论：NHC具有较良好的体外细胞相容性。
　　[关键词]羟基磷灰石；壳聚糖；细胞相容性；人骨髓间充质干细胞
　　[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）06-0855-04
　　
　　Cellular biocompatibility of nature hydroxyaptite/chitosan composite
　　TANG Xiao-jun1，GUI Lai1，LV Xiao-ying2
　　（1.Department of Cranio-maxillofacial Surgery, Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100144，China. 2. State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science and Medical Engineering, Southeast University, Nanjing 210096,Jiangsu, China）
　　
　　Abstract： Objective To investigate the cellular biocompatibility of nature Hydroxyaptite/ Chitosan composite（NHC）.MethodsThe composite was cocultured with osteoblasts derived from human bone marrow stem cells. The cellular biocompatibility was studied by means of the evaluation of proliferation capacity, alkaline phosphatase staining and scanning electron microscope observation.ResultsExcellent adherence and growth of osteoblasts were observed on the composite surface. There were no significant differences in both cell proliferation capacity and alkaline phosphatase staining between the experiment and control groups. SEM observation showed normal growth of osteoblasts and extracellular matrix generation in 24 hours. ConclusionNHC had good biocompatibility with the osteoblasts in vitro.
　　Key words：hydroxyaptite；chitosan；cellular biocompatibility；human bone marrow stem cells
　　
　　天然羟基磷灰石／壳聚糖复合材料是由猪骨提取的羟基磷灰石和壳聚糖交联法获得的（该材料合成方法已获得国家专利）[1]。其抗压强度达到人椎骨水平。理论上本复合材料拥有羟基磷灰石良好生物相容性，引导骨形成，骨融合特性和壳聚糖的体内降解吸收，抗菌抗癌和良好的骨整合等特殊的医用生物学特性[2]。作为一种新复合成的材料，我们需要对其进行生物相容性评定。该材料骨内植入的扫描电镜情况已经发表[3]。本文主要是评价该材料在体外的细胞相容性。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1实验试剂和仪器：1∶50肝素抗凝的正常成人骨髓采自整形医院临床患者，经患者知情同意。患者无感染、血液系统、免疫系统疾病等系统性疾患。Percoll（Amershan-Pharmacia公司），低糖型DMEM培养基（Gibco BRL公司），胎 牛 血 清（天津川叶生物公司），青、链 霉 素（华北制药股份有限公司），胰酶（Amershan-Pharmacia公司），二氧化碳培养箱（FORMA 3111型美国），离心机（KUBOTA2100日本），倒置相差显微镜（LEICA DM IRB 德国），JSM-T300扫描电镜，超净工作台YJ-875型（北京昌平净化设备厂 国产），碱性磷酸酶试剂盒（北京中山生物公司产品），骨钙素RT-PCR引物（赛百盛公司），AMV反转录试剂盒（promega），酶联仪（TECAN SUNRISE日本）。
　　1.2人骨髓间充质干细胞的分离及培养：正常人1∶50肝素抗凝骨髓5ml，用含10％FBS的L-DMEM 1∶5稀释离心1200 rpm 5min，去掉脂肪层，重悬细胞。用1.073g/mlPercoll分离，将密度为1.073g/ml Percoll先置于试管的底部，然后按照1∶1的比例缓慢滴加稀释后的骨髓，离心 2500 rpm 30min，收集位于界面层的单个核细胞。用L-DMEM洗涤两次，重新悬浮于含10% FBS的L-DMEM培养基中，接种于25cm2培养瓶内，密度为2.0×105/cm2，置于37℃，含 5%CO2的培养箱内孵育。48h后除去非贴壁细胞，更换新鲜培养液。之后每3至4天换一次液。待贴壁细胞生长至90%汇合时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶1比例传代，第2代以后的细胞按1∶2或1∶3的比例传代培养。
　　1.3人骨髓间充质干细胞的鉴定
　　1.3.1 MTT比色实验测定细胞生长曲线：用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10% FBS的L-DMEM配制成细胞悬液，以每孔1.5×104个的细胞密度接种于96孔板中，每孔体积200μl。将培养板移入CO2培养箱中，在37℃、5% CO2和饱和湿度条件下培养。分别于1、2、4、6、8、10和12天各取出三孔，每孔加入MTT 20μl，37℃孵育4h，中止培养，弃上清，每孔加150μl二甲基亚砜（DMSO），震荡10min,使结晶物充分溶解，选择490nm波长，在酶联仪上测定各孔光吸收值（optical density value OD）。
　　1.3.2人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化能力的鉴定。

　　1.3.2.1 MSC向成骨诱导：取体外扩增的第3代MSCs，以3.0×103/cm2的浓度接种于放置有无菌处理的盖玻片的六孔板中，每孔内加2ml含10% FBS的L-DMEM培养液。当细胞贴壁生长达到60%～70%汇合时，加入骨诱导剂100nM Dex、0.25mM AsA和 10mMβ-GP，进行诱导培养。对照组只加培养基。在第4、8、12和16天分别观察各孔中细胞的形态学和组织化学变化情况。
　　1.3.2.2 碱性磷酸酶活性测定：按碱性磷酸酶试剂盒说明进行操作。取进行诱导后的MSCs的上清液进行测定，分别取4、8、12和16天 4个时间点测定。
　　1.3.2.3 RT-PCR分析骨钙素mRNA：人MSC在对照组和含诱导剂培养基中分别培养7天和14天。消化后收集细胞，采用QIAGEN公司的RNeasy mini column 试剂盒提取总RNA。提取后的RNA标本经测定OD 260/280 测定比值为2.0～2.1。取1μg总RNA采用mRNA Selective PCR试剂盒进行RT-PCR反应，方法按使用说明书进行。45℃ 30min反转录，各取10μl的cDNA作为模板进行PCR反应，反应条件为：94℃30s,58℃30s，72℃1min，35个循环，72℃延伸10min。产物在1%琼脂糖凝胶上电泳。
　　1.3.3 人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞的诱导分化能力的鉴定：将hMSC接种于24孔板中，每孔细胞数为4×104个。24h后添加脂肪细胞诱导液，为高糖DMEM，内含10%FBS、0.5mmol/L异丁基-甲基黄嘌呤、0.2mmol/L吲哚美辛、10-3mmol/L地塞米松、10mg/ml胰岛素。诱导2周，每周换液2次。2周后弃去培养基，PBS洗涤3次，10%福尔马林固定，油红O染色。
　　1.4 天然羟基磷灰石/壳聚糖复合材料复合细胞培养：将支架材料制成厚0.2cm，直径1cm的圆片状，双蒸水清洗，室温下自然干燥24h，纸塑包装密封，环氧乙烷消毒。
　　1.4.1人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在天然羟基磷灰石/壳聚糖复合支架材料上的贴附实验：无菌条件下在超净台上将消毒的材料圆片放入24孔板，将体外扩增的hMSC经过消化离心，得到细胞悬液，按细胞密度2×l06/cm2均匀接种在材料上。加入含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，置入细胞培养箱内培养4～6h。
　　1.4.2 MTT法分析hMSCs与天然羟基磷灰石/壳聚糖复合支架材料复合培养的成活率和增殖能力：将传至第3代的细胞以1×104/ml接种于96孔培养板, 每孔加入培养基200μl,37℃, 5%CO2培养箱中培养, 分别于第2、4、6及8天,每孔加入MTT20μl，继续培养4h，吸出培养液后，加入DMSO液(150μl/孔)，室温下于微孔板振荡嚣上振荡10min，使结晶物溶解，在酶标仪上检测各孔的A值(选择波长570nm)。统计学方法对所测数据进行方差统计分析。
　　1.4.3碱性磷酸酶(ALP)活性测定：将支架材料3块置于六孔培养板,并设3孔为不加材料的空白对照组。将hMSCs以1×105/孔接种于预湿材料上，在条件培养基下(含抗坏血酸、地塞米松和甘油磷酸钠)培养3周后，收集细胞，采用磷酸苯二钠法测定样品ALP活性。
　　1.4.4扫描电镜观察：hMSCs-支架材料复合体标本取出后用2%戊二醛固定，系列丙酮中脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金，用JSM-T300扫描电镜观察细胞与材料贴附和基质分泌及生长情况。
　　
　　2结果
　　
　　2.1采用密度梯度离心法成功分离获得了MSCs。用密度为1.073g/ml的Percoll对骨髓进行密度梯度离心，经过2,500rpm 30min离心后，分离得到了富含MSC的单个核细胞，将其接种于含10％经过筛选的FBS的培养基中，细胞于48h后贴壁，72h后出现纺锤状细胞（图1），6～12天细胞生长迅速，贴壁的MSCs平均约12天后形成克隆（图2），两周左右细胞近80%～90%汇合，出现致密的贴壁层（图3）。
　　2.2 MSC的生长曲线（图4）
　　2.3 MSCs向成骨细胞诱导分化
　　2.3.1 MSCs向成骨细胞诱导分化过程中的形态学变化：本实验采用包含有100nM Dex、0.25mM AsA和10mMβ-GP的骨诱导液进行MSCs向成骨细胞定向分化的实验研究。应用Von Kossa 染色和X光衍射等方法对诱导后的细胞表型进行检测和鉴定。在16天的诱导过程中，细胞形态发生明显的变化，与对照组有显著差别。在进行骨诱导第2天时，细胞形态发生改变，第4天更为明显，大约30%～40%的MSCs由纺锤状变为立方型；第8天时，实验组大约80%以上的MSCs成为立方形或多角形，细胞基质中出现钙化斑；第12天时，实验组培养皿中广泛均一地形成骨样物质，矿化物形成明显，并且开始形成多层小结结构；第16天时，成骨诱导组细胞基质形成广泛的矿化，并形成钙化结节（图5）。而对照组细胞形态仍然是纺锤状。
　　2.3.2 RT-PCR分析骨钙素mRNA：RT-PCR分析，在7天、14天时诱导组中骨钙素的表达明显增高（图6）。
　　2.4 MSCs向脂肪细胞诱导分化：原代培养的MSC呈集落样增殖,细胞呈长梭形或长三角形,类似成纤维细胞。传代细胞第3～5代形态逐渐趋于均一的长梭形，核位于中央，细胞分布均匀。诱导36～48h后,光镜下可见部分细胞沿胞膜下出现环形细颗粒层，折光性较强，细胞核仍位于中央，以后颗粒逐渐增多，并向细胞中央、核周围逼近，颗粒逐渐变大；细胞仍呈长梭形,但胞体变大和变宽，细胞两极变短（图7），油红O染色证实这些颗粒为中性脂肪颗粒。2～6天后，颗粒细胞明显增多，分化较早的细胞，在细颗粒增多的同时，颗粒逐渐融合成光镜下可见的小圆形脂滴，晶莹透亮，整个细胞内从胞膜到细胞核之间充满大小较均一的脂滴，呈葡萄串状(图8)，胞体明显变大，并趋于椭圆形。
　　2.5统计测定
　　2.5.1 hMSC增殖度测定：随着培养时间的延长,各组细胞数量都有所增加，各组细胞增殖度差异无显著性(P＞0.05)。见表1。
　　
　　2.5.2碱性磷酸酶(ALP)活性：材料组ALP活性为(2.1259±0.1094)，空白对照组为(2.1337±0.1101)，材料组与对照组之间无显著性差异(P＞0.105)，说明材料对hMSCs进行成骨细胞诱导未见不利的影响，且对诱导的成骨细胞的ALP活性没有影响。
　　2.5.3扫描电镜：材料表面在扫描电镜下为微粒状，具有微孔(图9)。培养4h，细胞附着于材料表面，形态多样，呈有多个突起的梭形或多角形，细胞间连接松散，细胞跨越微孔表面或向孔内长入(图10)。培养8h后细胞连接成片，可见细胞表层有丝状纤维形成(图11)。培养24h后细胞形成单层结构，细胞紧密，可见到细胞外基质（图12）。
　　
　　3讨论
　　
　　细胞相容性是组织工程对支架材料的最基本的要求之一。细胞培养法检测材料细胞相容性是一种快速、简便、重复性好又价廉的方法，在材料生物相容性评价中起着越来越重要的作用。体外材料复合细胞培养进行细胞相容性试验可以排除体内试验的各种复杂因素之间的相互干扰。可以从细胞水平直接观察某一单一因素所致的细胞与生物材料复合生长的情况，可以直接观察细胞对材料的趋化、粘附和细胞在材料表面及内部的生长、增殖和分化。结果较敏感和客观。

　　3.1细胞相容性试验中的细胞选择：1948年Rosen Bluth等首次报道利用鼠成纤维细胞培养来筛选聚合物，进行细胞毒性试验评价生物材料的生物相容性的研究。目前一般多选用成纤维细胞株(如L-929)作为实验细胞[4]。越来越多学者认为不同组织来源的细胞对材料的敏感性是有差异的[5]，应该根据材料植入体内的不同部位及使用目的选择人体不部位或/和组织来源的细胞实验细胞，使体外细胞培养对机体内环境的模拟更趋真实，其结果更为准确与客观。由于我们研究的材料为骨替代材料最终是要被种植到骨组织内，需要长期和骨组织进行生物学接触。因此骨替代材料应选择骨组织来源的细胞才能准确反映材料最终在生物体内的真实状况。比如：成骨细胞，或前体成骨细胞等[6]。
　　3.2复合材料细胞相容性：材料和细胞相容性有很多的影响因素，比如：金属材料基质能，表面自由能，界面自由能，材料表面的粗糙程度[7]，材料表面基团种类和结构, 表面电荷, 材料表面的改性和修饰情况等等因素。Baier[8]等认为材料表面的特性和自由能决定其细胞生物粘附性，他们通过在新西兰白免体内移植几种不同表面能的金属材料发现,低表面能材料粘附的细胞呈现球形或近球形,粘附作用极弱。高表面能材料的表面可以被活体细胞完全覆盖,表面粘附的细胞呈现出扁平、拉长的形态,粘附作用很强。因此高表面能材料的表面更有利于细胞的粘附与铺展。生物材料表面的化学结构，表面基团或改性修饰对细胞的粘附和生长是另一个重要因素。Lee[9]等认为材料表面不同功能基团具有不同的细胞特性，比如羧基、羟基、磺酸基、胺基、亚胺基及酰胺基等基团可促进细胞的粘附和生长。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）肽表面修饰对HA材料的细胞相容性有明显的优化作用[10]。并且在生理状态下，一切脊椎动物细胞表面都带有分布不均匀的负电荷。因此我们认为带正电荷的材料表面与带负电荷的细胞之间的静电吸引作用有利于细胞的粘附。
　　在本实验中，将复合材料和成骨细胞在体外进行复合培养，通过电镜形态学对材料和细胞复合检查发现细胞在材料表面生长活跃，培养早期细胞散在于材料表面，呈有多个突起的梭形或多角形，细胞间连接松散。随培养时间延长，细胞增殖，连接成单层或生长附着于较大孔隙表面，细胞排列紧密，部分区域有细胞外基质形成。即4h细胞贴附生长，8h连成片状，24h细胞在材料表面形成单层或长入孔隙内，同时有细胞外基质分泌。这说明骨髓基质细胞可以在材料表面贴附生长，并伸入材料之中，可在材料表面及内部伸展和繁殖，保持细胞的梭形形态，并能分泌胶原纤维和钙离子颗粒等细胞外基质。本实验也同时应用MTT法对细胞增殖进行检测，发现与天然羟基磷灰石/壳聚糖复合材料复合培养的骨髓基质细胞其增殖不受影响，表明该材料对骨髓基质细胞的生长分裂无明显的干扰作用。通过ALP测定进一步检测该材料对细胞功能状态的影响，ALP是成骨细胞分化成熟的重要标志，被认为与成骨细胞的分化有密切关系。本实验显示，实验组和对照组ALP活性均有增高，同期比较差异无显著性。说明这种生物材料不仅对骨髓基质细胞的增殖无明显阻滞作用,同时对细胞的功能尤其是对于骨髓基质细胞向成骨细胞转化无明显影响。由上述实验结果可得出该材料具有良好的细胞相容性，无细胞毒性。可以作为骨组织工程研究中种子细胞的生物支架。但是这仅仅是在体外短期试验的结果，该材料在生物体内具体反映如何仍需要进一步的试验论证。
　　根据前述的影响生物材料细胞相容性的因素分析，考虑本实验材料细胞良好相容性与以下因素有关。天然羟基磷灰石具有较高的结合钙离子的能力，而局部钙离子浓度的增加，可在材料表面形成高密度的正电荷层，有利于成骨细胞的粘附、生长和增殖。壳聚糖是可降解和可吸收的高分子材料，它表面具有较多的化学基团，可通过调节表面的亲水性和本身的生理活性促进细胞的粘附和生长。壳聚糖也是自然界唯一的带正电荷的多糖，可以和带负电荷的细胞相互吸引，有利于细胞粘附。该材料的降解性有利于材料与机体之间的物质交换，材料表面壳聚糖成份的降解更为细胞的伸入提供了位置，对形成早期的骨性结合比较有利。从理论上我们推测本材料可能随着壳聚糖的吸收，成骨细胞长入，骨组织形成逐渐长入、连接并和羟基磷灰石形成骨性愈合，最终实现完全的骨整合。
　　
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　　[收稿日期]2008-02-26[修回日期]2008-05-11
　　编辑/张惠娟

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