针刺足三里对运动大鼠自由基代谢影响的研究

来源:用户上传      作者: 刘晓锋　王蕴红　洪　峰　赵明华　张露芬

　　摘 要：为探讨针刺足三里穴对运动大鼠自由基代谢的影响，采用跑台递增负荷训练模型，观察一般情况、Hb、肌糖原、肝糖原、肌肉及肝组织中的SOD、MDA含量和HSP70表达。结果发现，针刺足三里穴能改善运动大鼠整体健康状况，减轻大鼠体重、Hb以及肝糖原、SOD含量的下降，降低MDA含量和HSP70表达。提示针刺足三里穴可通过激发机体内在调节能力，改善自由基代谢，促进机体对大强度负荷的适应，起到延缓运动性疲劳发生的作用。
　　关键词：针刺；足三里；运动性疲劳；超氧化物岐化酶；丙二醛；热休克蛋白
　　运动性疲劳的防治是运动医学界研究的热点。目前的研究多集中在运动性疲劳发生机理的深入探讨和药物抗疲劳等方面，有关针刺防治运动性疲劳的动物实验鲜见。诸多研究证实，剧烈运动可促使活性氧产生，体内脂质过氧化增强，丙二醛(MDA)水平升高而导致运动能力下降，导致运动性疲劳、近年针灸抗氧化的临床和实验研究也取得了一定进展。为此，本课题采用跑台递增负荷训练模型，观察针刺足三里穴在提高大鼠运动能力、防治运动性疲劳、纠正体内自由基代谢失衡等方面的作用。
　　
　　1　材料与方法
　　
　　1．1 实验动物 SD雄性大鼠54只，清洁级，体重200±20g，由北京维通利华实验动物中心提供。室温20±2℃，相对湿度45～65％，自然光线，自由饮食。
　　1．2 实验方法 常规喂养2日后，实验动物随机分为6组：安静组、安静+针非穴组、运动组、运动+针非穴组、运动+电针组、运动+手针组。其中安静、安静+针非穴组大鼠不进行任何运动，其余四组大鼠采用递增强度方式在水平电动大鼠跑台上训练。前4周速度分别为：22m／min、27m／min、32m／min、37m／min，每日训练25min，每周7d。第5、6周速度为42m／min，每日训练35min，每周7d，共训练6周。
　　训练后即刻，实验组针刺足三里穴，电针组采用韩氏电针仪，针刺电刺激2～100Hz交替疏密脉冲波，强度2～5mA；手针组每5 min行针一次，平补平泄。对照组针刺尾部。各组均隔日针一次，每次10min。
　　末次定量负荷训练后即刻，断头处死动物。取全血0．02mL，测定Hb含量。取大鼠肝脏、腓肠肌冰浴制备匀浆液待测。取大鼠肝脏、腓肠肌置10％福尔马林固定备用。
　　Hb采用氰化高铁比色法测定；糖原用蒽酮比色法测定；SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，MDA含量采用TBA缩合比色法测定，组织匀浆液蛋白测定采用考马斯亮蓝法。
　　形态学观察：取充分固定的大鼠组织，常规酒精梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，连续切片5μm制备切片并作HE染色，光镜下观察组织结构。
　　HSP70表达：采用ABC免疫组化法检测。每组随机取5只大鼠的组织切片，每张切片随机选取3个视野测定，用美国产TN―8502型图像分析系统对免疫组化切片进行定量分析。
　　1．3 数据处理 运用SPSS11．0统计软件处理，组间比较采用t检验，显著性标准为P＜0．05。
　　
　　2 结 果
　　
　　2.1 针刺足三里穴对大鼠一般情况的影响 训练中后期，运动组、运动+针非穴纽大鼠食欲下降、大便稀溏、体瘦毛松、神疲乏力等脾虚劳倦症状日渐明显，运动电针、手针组大鼠食欲良好，皮毛光洁，健康活泼。
　　
　　如表1所示，第3周至实验末，运动组大鼠体重显著低于安静组(P＜0．05及P＜0．01)。第4周至实验末，运动+电针、手针组大鼠体重显著高于运动组(P＜0．05)；与安静组比较无显著差异。
　　
　　2.2 针刺足三里穴对大鼠血红蛋白含量的影响 如表2所示，末次定量负荷训练后即刻，运动组大鼠Hb浓度显著低于安静组(P＜0．01)。运动+电针、手针组大鼠Hb含量显著高于运动组(P＜0．01)；与安静组比较无显著差异。
　　
　　2.3 针刺足三里穴对大鼠糖原含量的影响 如表3所示，末次定量负荷训练后即刻，运动组大鼠肌、肝糖原含量均显著低于安静组(P＜0．01)。运动+电针、手针组大鼠肌糖原含量也显著低于安静组(P＜0．05)；肝糖原含量与安静组比较无显著差异，但显著高于运动组(P＜0．05)。
　　
　　2．4 针刺足三里穴对大鼠骨骼肌、肝脏SOD含量的影响如表4所示，末次定量负荷训练后即刻，运动组大鼠骨骼肌、肝脏SOD含量显著低于安静组(P＜0．01，P＜0．05)。运动+电针、手针组大鼠骨骼肌、肝脏SOD含量显著高于运动组(P＜0．01)；与安静组比较无显著性差异。
　　
　　2．5 针刺足三里穴对大鼠骨骼肌、肝脏MDA含量的影响如表5所示，末次定量负荷训练后即刻，运动组大鼠骨骼肌、肝脏MDA含量显著高于安静组(P＜0．01)。运动+电针、手针组大鼠骨骼肌、肝脏MDA含量显著低于运动组(P＜0．05)；与安静组比较无显著性差异。
　　2．6 大鼠骨骼肌、肝脏形态学观察 光镜观察可见：与安静组比较，运动组大鼠骨骼肌HE染色未见显著形态改变；肝组织可见细胞略显肿胀，核深染，汇管区及小叶间血管轻度扩张。运动+电针、手针组大鼠骨骼肌、肝组织HE染色无明显改变。
　　
　　2．7 针刺足三里穴对大鼠HSP70表达的影响 如表6所示，末次定量负荷训练后即刻，运动组大鼠骨骼肌、肝组织HSP70表达显著高于安静组(P<0．05，P＜0．01)。运动+电针、运动+手针组大鼠骨骼肌、肝组织HSP70表达低于运动组(P＜0．05)；与安静组比较，肝组织HSP70表达显著升高(P＜0．05)，骨骼肌HSP70表达无差异。
　　2．8 大鼠骨骼肌、肝脏SOD、HSP70相关性检测 如表7、8所示，通过SPSS11．0统计软件进行相关分析可见，大鼠骨骼肌SOD含量与HSP70表达高度相关，肝组织SOD含量与HSP70表达无相关性。
　　
　　
　　3 讨　论
　　
　　实验发现，训练中后期，运动组大鼠食欲下降、大便稀溏、体瘦毛松、神疲乏力等脾虚劳倦症状日渐明显，体重和Hb含量亦显著低于安静组。运动+电针、手针组大鼠上述脾虚症状不明显，体重及Hb含量高于运动组，与安静组无显著差异。提示针刺足三里穴对脾胃功能有良性调节作用，能预防运动大鼠脾虚症状的发生。金元时代的李东垣就提倡“以胃合三里穴推而扬之以伸元气”，认为刺激足三里穴有补益脾胃元气之功，本实验支持此观点。
　　中医理论认为，脾主运化，脾胃功能与物质代谢密切相关。本研究发现，末次定量负荷训练后即刻，由于运动过程中作为能源物质被利用，各运动组大鼠肌糖原含量均显著低于安静组。而运动+手针纽、电针组大鼠肝糖原含量与安静组相比无显著差异，却显著高于运动组。提示针刺足三里能延缓运动大鼠肝糖原含量下降。分析这可能与针刺足三里使肝糖原储备增加和／或促进运动中糖异生有关。此外，由于疲劳累积引起消化系统功能紊乱，运动组出现的食欲下降、大便稀溏等脾虚

症状使大鼠摄入、吸收及合成均不同程度减少，而消耗却持续增加，这也是运动组大鼠糖原及体重下降的主要原因。
　　实验发现，末次定量负荷训练后即刻，运动组大鼠组织SOD含量显著低于安静组，MDA含量高于安静组。运动+电针、手针组大鼠组织SOD含量显著高于运动组；MDA含量低于运动组，与安静组无显著差异。提示针刺足三里能明显提高疲劳大鼠体内抗氧化酶活性，降低机体增强的脂质过氧化反应，从而保护细胞免受运动损伤，因而具有提高运动能力，延缓大鼠运动性疲劳发生的作用。
　　分析原因我们认为，经过6周持续大负荷训练，大鼠已处于疲劳状态。剧烈运动和大强度的耐力训练可引起机体氧化应激，使内源性自由基产生增加、脂质过氧化增强，同时体内的抗氧化酶活性也会相应提高。
　　实验还发现，与报道，一致，不同组织的SOD、MDA含量不同，且大强度训练对不同组织自由基生成和代谢的影响也不一样。从实验结果可看出，与骨骼肌相比，大鼠肝脏SOD活性较高，同时MDA含量也较高。可能因肝脏是代谢旺盛的组织，许多氧化代谢均在此进行，因而产生的自由基较多，同时，机体为了能及时有效的清除生成的自由基，自由基清除系统的酶活性也相应较高。肝脏是能量储备、利用的直接组织之一，保证肝细胞功能的完整不仅能提高机体的运动能力，亦可提高机体免疫等整体机能。
　　肝脏是机体重要的代谢器官，也是全身性应激损伤发生时的靶器官，临床病理过程的研究多集中在HSP70与肝脏缺血再灌注损伤方面，而运动性疲劳与肝脏HSP70表达的相关研究尚未见报道。本实验发现，末次定量负荷训练后即刻，运动各组大鼠肝组织HSP70表达均显著高于安静组。结果提示，运动应激可诱导大鼠肝组织HSP70表达升高，增强对肝脏的保护作用。推测其机制可能是：①直接作用，即分子伴侣作用。通过HSP的大量产生来维护细胞的生存和机能；②间接作用，可能与氧自由基有关。已有研究表明，HSP可以抑制NADH氧化酶，减少氧自由基的来源，此外，HSP还可与糖皮质激素受体结合从而促进SOD的生成，SOD作为OFR的清除剂可以减少OFR造成的LPO作用，保护细胞正常生理机能。
　　根据以往研究报道及本实验结果，机体对运动负荷越不适应，应激程度就越高；反之，如果机体适应性提高，则运动负荷相对机体的应激程度就会降低。本实验发现：运动+电针、手针组大鼠组织HSP70表达显著低于运动组，表明针刺足三里可促进机体适应能力的提高，降低运动大鼠应激水平，预防运动性疲劳对机体组织细胞的损害。
　　研究同时发现，大鼠骨骼肌HSPT0表达与SOD含量之间呈负相关趋势。Smolka等人的实验出证实了此观点。结果提示，大强度运动时，骨骼肌细胞内产生的活性氧超出抗氧化酶系统的防御能力时，HSP70起到补充抗氧化应激防御系统的作用，即运动应激诱导的骨骼肌细胞HSP70的合成具有抗氧化应激的能力。
　　此外，由实验结果中针穴位组与针非穴组的显著差异可见，针刺穴位(足三里穴)和非穴位(大鼠尾部)确有显著不同的效应，因而针刺作用的起效机制并非单纯的机械性刺激所引起。并且，本实验分组中加入了电针组和手针组的对照比较，是为了检验这两种常用针刺方法作用效果的异同。试验中电针组大鼠连接的韩氏电针仪，我们选用的波形为随机变化的疏密脉冲波(频率为2～100 Hz交替)，是由于这种波形电脉冲的频率随时发生不规律的变化，机体不易产生电刺激适应现象。手针组大鼠我们采用每5min行针一次，平补平泻的方法进行治疗。结果发现，电针组与手针组大鼠各项指标均无显著性差异，说明手针和电针这两种干预手段的作用效果接近。
　　综上所述我们认为，针刺足三里可通过激发机体的内在调节能力，补益脾胃元气以纠正运动大鼠降低的体重、Hb，提高糖原含量和抗氧化酶活性；降低HSP70的反应性高表达，促进机体对大强度负荷的适应，从而起到延缓疲劳，提高运动能力的作用。

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