microRNAs在心力衰竭分子通路中作用研究进展及中医药干预展望

来源:用户上传      作者: 梁勇

　　摘要：心肌肥厚是心力衰竭的特征之一，具有高发病率、高致残率、高死亡风险。控制心脏生理功能的分子通路的显著变化是心肌肥厚和心衰进展的基础机制。microRNAs（miRs）作为能够调控基因表达的小核苷酸序列，可能在调控上述分子通路变化中发挥重要作用，这源于心肌肥厚心力衰竭时显示出高度特异性的miRs表达谱。并且，在心肌肥厚和心力衰竭动物模型实验研究中，以miRs为靶目标的实验性干预已经显示出了有益的效果。本文以分子通路为主总结miRs在心肌肥厚和心力衰竭中作用机制及并对中医药干预进行展望。
　　关键词：心肌肥厚；心力衰竭；microRNAs；中医药
　　中图分类号：R541.6 R256.2 文献标识码：A
　　doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2014.04.050
　　文章编号：1672-1349（2014）04-0483-03
　　正如佛朗西斯・里克里于1958年提出的“分子生物学的中心法则”中描述的那样，生物信息的传递是一个极其庞大复杂的调控系统，包括翻译后修饰、转录调控、表观遗传机制等内容，近些年，microRNAs（miRs）也被看做是其中的重要环节[1]。miRs是高度保守的短单链非编码RNA分子，以mRNA分子非翻译区为特异性互补序列，通过形成一个大的、多蛋白的RNA诱导沉默复合物（RISC）使靶mRNA沉默。单个miRs调控多种mRNA的表达，并通过他们之间相互协同反应导致后续翻译模式的改变；相反的，一种mRNA又会同时被多个miRs所调控，从而形成错综复杂的调控网络。miRs不仅参与心脏压力超负荷所致的初始适应性肥厚反应，而且参与随后的病理生理改变，进而导致心脏功能恶化以及心肌和细胞外基质（ECM）的重建。miRs对于心脏病理生理的广泛参与开辟了其临床应用的前景，不仅可以作为心脏生物标志物，而且成为了潜在的临床治疗靶点[2]。
　　1 miRs生物学研究概要
　　计算机序列分析确认人类基因组中存在超过1 000种的miRs。miRs长度为18个～25个核苷酸小RNA，大部分miRs基因位于编码基因内含子区，并受亲代编码基因转录调控。miRs基因由RNA聚合酶Ⅱ转录为长的pri-miR分子后，被核酸酶RNase Ⅲ Drosha和辅助因子DGCR8剪切成60个～100个碱基大小、具发夹结构单链RNA前体（pre-miRNA），后者经输出蛋白-5转运出核。在胞浆，pre-miRs被另一 RNase Ⅲ Dicer 剪切形成双链 miRNA，其中一条链被降解，另外一条链则装配入RISC成为有功能的miRs，通过降解或抑制翻译的方式在mRNA沉默中发挥作用。miRs对心脏发育和内环境稳态具有非常重要的作用，DGCR8基因敲除通过破坏miRs合成而形成致命性心力衰竭[3]；同样，RNase Ⅲ Dicer的缺失也能导致心脏先天发育不良，并且在成年人中将该基因敲除也可导致心肌病[4]。最近的证据进一步使我们增强了对miRs合成调控复杂性的理解，并支持了Smads、p53、雌二醇受体等转录因子的调控作用[5]。
　　2 miRs在心肌肥厚分子通路中的作用
　　在长期的压力超负荷、心肌局部缺血性损伤或神经内分泌的异常状态等病理性因素刺激下，心肌肥厚起初作为适应性改变起到保护心脏功能和使心室壁张力正常化的作用，但这最终会导致心肌细胞坏死、血管损伤和炎症、纤维化、胎儿基因激活、代谢紊乱而成为病理性的过程。现就关于miRs在心肌肥厚和心力衰竭分子信号通路中作用的最新证据作一总结。
　　2.1 钙依赖性分子通路 细胞内Ca2+浓度微量改变既能触发细胞信号通路。细胞内Ca2+浓度可被受机械应力和血流动力学控制的Na+/H+交换蛋白通过Na+/Ca2+逆向转运蛋白抑制Ca2+外逃的方式以及β-肾上腺素能神经张力增加所提高，并通过GTP结合蛋白（Gs）、腺苷酸环化酶（AC）、蛋白激酶A（PKA）磷酸化方式最终增加内质网Ca2+-ATP酶表达[6]。心肌肥厚信号通路能够被钙调素依赖性蛋白磷酸酶（CN）和钙调素依赖性蛋白激酶（CaMK）调控[7]。简而言之，CN使活化T细胞核因子家族（NFATs）去磷酸化并使之入核，与其他转录因子（尤其是GATA4和MEF2a）相互作用诱导心肌肥厚相关基因的表达[8]；相反，CaMK Ⅱ则通过HDAC4去磷酸化并使之出核，达到抑制心肌肥厚相关基因表达的作用。多种miRs可以抑制钙依赖性分子通路。腺病毒介导的miR-1过表达通过负向调控CaM、MEF2a和GATA4等蛋白的表达抑制心肌肥厚，而且miR-1基因敲除导致上述蛋白表达的上调[9]。另外，无论在体内还是体外，miR-1还能通过调控大鼠心肌细胞Na+/Ca2+交换器NCX1表达和活化促进Ca2+排出，从而发挥心肌保护作用[10]。小鼠心肌细胞miR-26过表达抑制GATA4依赖性转录过程和内皮素-1（ET-1）诱导的心肌肥厚及细胞凋亡敏感性[11]。心肌肥厚也能够被CN和NFATc4等细胞因子拮抗，而且腺病毒转染miR-133的小鼠心肌细胞可干扰CN-NFAT通路并阻止α1-肾上腺素诱导心肌肥厚[12]。此外，CN过表达的心肌肥厚模型显示出低表达的miR-133，这种趋势能够被CN抑制剂环孢素A所逆转；反过来，CN的表达又能被miR-133转染所下调，而不是被共转染的其反义寡核苷酸下调[13]。miR-9通过降低转录辅激活物心肌素（myocardin）表达水平起抑制心肌肥厚，并改善心脏功能的作用。心肌素是NFAT下游靶分子，在生理条件下仅少量表达，但在心肌肥厚时经CN/NFAT途径被强烈激活[14]。相反，其他一些miRs却经CN/NFAT途径促进心肌肥厚。Costa Martins等[15]新近描述了miR-199b以具有减弱NFATs功能的心肌肥厚抑制因子双特异性酪氨酸磷酸化调控激酶（1aDyrk1a）为靶分子参与CN/NFAT信号通路增强的循环路径。相反，在心衰小鼠模型体内通过沉默miR-199b促使Dyrk1a正常表达能够抑制NFAT活性，从而显著抑制甚至是逆转心肌肥厚和纤维化。因此，通过miR-199b调控Dyrk1a表达构成了一个前反馈机制，促进了病理性心肌肥厚的进程。miR-23a受NFATs调控的同时，以心肌肥厚负向调节因子MuRF1为靶分子。无论在小鼠体内还是体外，miR-23a过表达均能显著降低MuRF1水平并加重心肌肥厚，同时其基因沉默则表现出相反的作用[16]。miR-30b-5p在心肌肥厚时呈低表达状态，He等[17]通过功能获得和功能丧失的研究证实，miR-30b-5p通过直接抑制CaMKIIδ表达参与心肌肥厚进程。 　　2.2 PI3K/Akt信号通路 磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）途径作为促进心肌肥厚主要通路之一可被胰岛素样生长因子-1（IGF-1）激活。活化的胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）磷酸化胰岛素受体底物蛋白后激活PI3K和Ras蛋白，进而调控错综复杂、相互交叉的下游分子通路。活化的PI3K催化膜磷脂PIP2磷酸化为PIP3，后者募集Akt及其激活剂3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK-1），活化的Akt主要通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和抑制心肌肥厚抑制因子糖原合成酶激酶-3（GSK-3）调节心肌细胞肥大反应。另外，活化的Akt还能钝化叉头框转录因子家族（FOXOs）部分亚族活性，并促使其转移至胞质[18]。Ras蛋白则以结合GTP的活化形式募集促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）至质膜。MAPK是构成耦合更大范围胞外信号和胞内进程（如：分化、迁移、增殖、凋亡等）的核心信号传导通路之一。MAPK磷酸化多种胞质和核内蛋白，其中包括许多转录因子，如肌细胞增强因子-2（MEF2）和转录因子GATA-4。Hua等[19]证实IGF-1直接受miR-1和miR-133a调控，Elia等[20]通过功能获得性研究也确认IGF-1R是miR-1靶因子。并且，在主动脉弓缩窄和Akt过表达心肌肥厚模型中PI3K/Akt信号通路呈极度活跃状态的同时，miR-1和IGF-1呈交叉调控模式。FOXO3a可以诱导miR-1转录，但在心肌肥厚时被Akt灭活而丧失该作用。Kumarswamy等[21]进一步证实腺病毒介导SERCA2a基因治疗可通过Akt/FOXO3a通路恢复miR-1的表达，并改善心脏功能。Xu等[22]证实α受体激动剂或血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥厚时，miR-22表达下调导致PIP3去磷酸化生成PIP2，并抑制PI3K/Akt信号通路的肿瘤抑制蛋白同源性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）在心肌细胞的过表达，最终抑制了心肌肥厚的进展。同时，miR-378作为心肌细胞源性Ras系统和心肌肥厚负调节因子，能够抑制苯肾上腺素诱导的Akt磷酸化发挥心肌保护作用，相反，其基因敲除促进心肌肥厚的进展[23]。miR-23a也是一个潜在的心肌肥厚触发因子，并通过与FOXO3a相互作用进一步增强该作用。FOXO3a与miR-23a启动子区结合直接抑制其活性，同时，miR-23a功能获得和功能丧失的研究分别反相减少和增加FOXO3a表达水平[24]。 另外，miR-212、miR-132直接以FOXO3为靶因子并负向调节其表达，诱导心肌肥厚的发生；相反，miR-212、miR-132基因功能缺失和miR-132基因敲除可以预防压力超负荷诱导的心肌肥厚并阻止心力衰竭的发生[25]。
　　2.3 细胞因子信号通路 一些最重要的心肌肥厚激活因子属于细胞因子，其中大部分属于IL-6家族。它们与由膜糖蛋白130（gp130）亚基和第二亚基构成的酪氨酸激酶结合型受体结合获得配体属性，其下游信号转导受三条通路调控：PI3K/Akt、MAPK、两面神激酶/信号传导蛋白和转录激活物（JAK/STAT）。JAK/STAT途径通过配体诱发与受体结合的JAK磷酸化gp130胞内结构域，进而募集、磷酸化STAT家族细胞因子特异性成员而激活，然后STATs分离并形成二聚体进入细胞核，启动包括GATA4在内的一些基因的转录。对心肌肥厚整体效应是有益还是有害取决于哪种STATs被激活。一些STATs似乎能导致心肌细胞凋亡、心肌收缩力下降、离子通道功能紊乱、心肌纤维排列错乱和胎儿基因序列激活；相反，另一些STATs又能够拮抗上述作用，特别是STAT3主要起保护作用。在病理生理条件下，STAT3活性降低导致miR-199a表达增加，扰乱泛素-蛋白酶复合体系统，最终使肌节机构断裂，这着重强调了JAK/STAT途径是怎样通过抑制miRs来保护心脏的[26]。反过来，JAK/STAT信号通路亦可能是miRs的靶目标。在机械负荷应力下通过IL-6受体生存途径激活的信号转导中，gp130和STAT3是至关重要的。在压力超负荷和心衰时，乙酰转移酶p300水平的升高是上述反应中重要因素。连同MAPK一起，p300抑制miR-142的表达，促使压力超负荷时细胞因子介导的适应性生存信号的产生。Sharma等[27]近期通过功能获得和功能丧失的研究观察到细胞因子信号受抑制是miR-142负向调控gp130和NF-κB路径的结果。而且，miR-142过表达通过靶向调节p300和gp130，不仅抑制细胞生长，而且诱导细胞死亡和心脏功能障碍。相反，miR-150则通过负向调节p300表达逆转心肌肥厚[28]。另外，心肌肥厚时p300在激活一系列补偿性血管新生转录程序的同时诱导多种miRs的表达，其中高表达的miR-20a反过来负向调节p300的上述作用，最终促使心脏功能走向衰竭[29]。
　　2.4 细胞骨架信号通路 一些miRs已经被证实与细胞骨架蛋白密切相关。miR-1抑制肌动蛋白聚合抑制剂双解丝蛋白Twf1，因此，心肌肥厚时下调的miR-1增加Twf1的表达，进而阻止肌动蛋白聚合并通过调节细胞骨架结构促进心肌肥厚的进展[30]。miR-142也能够高度抑制α-辅肌动蛋白，这被认为与心肌病的发生及心肌细胞生长和凋亡有关。心肌肥厚时高水平的miR-142可能损害心肌细胞结构完整性并促使其凋亡[27]。广泛存在于心脏组织中的纤维母细胞生成细胞外基质，后者和肌肉组织共同维持心脏正常的结构和功能。然而，心力衰竭时，在纤维母细胞参与下ECM过度和错乱沉积，并转化为成纤维细胞，促进其迁移、增殖、分泌活性增强，这是心脏重塑和心肌僵硬度增加的主要因素之一[31]。miRs通过直接作用于纤维母细胞和干扰心肌细胞旁分泌的方式调控ECM。在心力衰竭模型中，miR-21在心肌细胞表达增加主要归因于纤维母细胞，并经由MAPK和PI3K/Akt途径促进其存活与活化。此外，miR-21还能抑制PTEN和软脂酰化磷蛋白（Sprouty-1），它们分别是PI3K/Akt和MAPK途径的负调节蛋白[32，33]。其他miRs不能干扰纤维母细胞活化，但是可以调控ECM基因。miR-29通过负向调节ECM组分mRNA起抑制纤维化作用。心肌梗死后转化生长因子β（TGF-β）表达上调抑制miR-29水平，并因此抑制胶原蛋白、纤维蛋白和其他ECM蛋白的合成[34]。miRs另一作用机制是调控促纤维化旁分泌生长因子，如TGF-β。两个抗纤维化miRs，即miR-30和miR-133，是TGF-β重要的负调节因子，二者均被病理性心肌肥厚所抑制，前者具有心肌细胞专属性，而后者被发现也存在于纤维母细胞中[32]。 　　3 中医药干预展望
　　miRs自被发现以来，已经被公认为基因表达调控的核心因子之一。miRs在心肌肥厚及心力衰竭分子通路作用机制的研究进展为临床诊治提供了新的方向，调节miRs的表达成为治疗疾病的可能有效途径。正如中国科学院人类基因组中心专家指出：“对于疾病的治疗，不管在现在还是在将来，都将主要从基因的功能着手，即从修饰或改变基因的表达与基因产物的功能着手，而不是以改变与纠正基因的结构为主要手段”[35]。正常情况下，miRs与靶因子之间形成非常精细的网络调控结构，共同对机体的发育及生理功能进行调控，这种miRs与靶因子之间存在动态的平衡状态，和中医强调的“阴阳平衡”思想不谋而合，正如《素问・生气通天论》指出“阴平阳秘，精神乃治；阴阳离绝，精气乃绝”。心肌肥厚及心力衰竭产生是miRs与靶因子间精细而有序的调控秩序被打破，即miRs与靶因子相互对立制约的动态平衡状态被破坏，产生阴阳偏盛偏衰的失衡改变，从而导致疾病的发生。中药复方制剂具有多组分、多途径、多方式、多靶点的作用优势，可广泛参与miRs调控网络，通过直接或间接调节相关miRs的表达，恢复miRs与靶因子之间的动态平衡，促进机体恢复阴阳平衡状态，从而达到“治病求本”的目的。这为中医药从miRs网络调控层次干预心肌肥厚及心力衰竭提出了新的研究方向。
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