海桐花部特征与繁育系统研究

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　　摘要    通过定点观测海桐的开花物候和花部形态特征，运用花粉-胚珠比、杂交指数、花粉活力与柱头可授性、人工授粉等方法对海桐的繁育系统进行研究。结果表明，海桐一般在3—4月开花，群体花期22 d，单花花期2～3 d，雌雄蕊同熟。依其花器官的形态不同，可分为雄蕊正常和雄蕊退化株海桐，其中雄蕊退化株海桐花药低于柱头，正常株海桐花药高于柱头。花开放第1天花粉活力最高（79.94%）、柱头可授性最强。花粉胚珠比（P/O）为3 209.59，杂交指数（OCI）为4，自然授粉海桐结果率为11.38%（n=123），人工异株异花授粉结果率为38.00%（n=50），其他处理结果率为0（n=30），综合以上结果可判断，海桐的繁育系统为自交不亲和的异交繁殖类型，不存在自动自花授粉和无融合生殖。
　　关键词    海桐;繁育系统;花粉活力;柱头可授性
　　中图分类号    S793        文献标识码    A
　　文章编号   1007-5739（2020）04-0119-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）
　　Abstract    By observing the morphological characteristics of flowering phenology and flower organs of Pittosporum tobira，the pollen-ovule ratio，hybridization index，pollen vigor and stigma receptivity and artificial pollination were used to study the breeding system of P. tobira.The results showed that P. tobira usually flowered from March to April，the flowering period of the population were 22 days，and the flowering period of the single flower were 2-3 days.The pistils and stamens of P. tobira flowers were mature at the same time.According to the different forms of flower organs，it could be divided into plants with stamen-normal or stamen-degenerated.The anthers of stamens-degenerated plants was lower than stigma，and the other was higher than stigma.At the first day of flower opening，the pollen was the most energetic（79.94%） and stigma receptivity was the most active.The pollen ovule ratio（P/O）was 3 209.59，the hybridization index（OCI）was 4，the natural pollination rate of P. tobira was 11.38%（n=123）and the rate of cross-pollination of human heterologous plants was 38.00%（n=50），the seedsetting rate of other processing was 0（n=30）.Based on the above results，it can be judged that the breed-ing system of P. tobira was a type of outcrossing that was self-incompatible and cannot be apomictic.
　　Key words    Pittosporum tobira;breeding system;pollen viability;stigma receptivity
　　植物繁育系統指包含花器官总体特征、花药与柱头寿命、开花形态、自交亲和与否以及交配系统在内，能够直接影响到植物后代遗传组成的所有有性特征，是繁育生物学和生物多样性保护管理的重要组成部分，其核心是植物交配系统[1-2]。通过了解植物的繁育系统，可以推测群体遗传结构，认识植物生活史，这对植物遗传多样性保护策略的制定具有重要意义[3]。同时，了解植物的繁育系统也是对其进一步有效利用或研究所必需的背景知识。
　　海桐（Pittosporum tobira）为海桐花科（Pittosporaceae）海桐花属常绿灌木或小乔木[4]。海桐的枝、叶、果实和种子等均具有药用价值，果壳和种子可开发保健型食用油[5]。此外，还可利用海桐制成安全、高效、天然的杀虫剂。同时，海桐抗逆性强，耐修剪，花香馥郁，对Pb、Cr等重金属有较强的吸收富集能力，且不受白蚁危害，抗火性强，是优良的园林生态植物[6-8]。本文通过对海桐花部特征和繁育系统的研究，掌握海桐的开花物候、花部器官的形态特征以及生物学特性，进而对海桐的繁育系统进行判断，以期对海桐多样性保护和良种繁育等提供有价值的参考。 　　1     材料与方法
　　1.1    研究地概况
　　本试验于2018年、2019年进行，以位于福州市于山风景区开花期的海桐为研究材料。试验地海拔约30 m，地处东经119°28′，北纬26°08′，属于亚热带季风气候。夏季炎热湿润，常有台风，冬季较温暖，很少出现寒冷的极端天气。四季常青，少有降雪，无霜期较长，可达326 d。有较为充足的光照和充沛的降水量;每年1—2月最冷，平均气温6～12 ℃，7—8月最热，平均气温33～37 ℃。
　　1.2    研究方法
　　1.2.1    开花物候。按照Dafni等[9]的方法，在2018年对福州市于山风景区的海桐进行观测记录群体花期、开花进程和单花花期。群体花期以有花开放开始记录日期，至群体中开花量≤10%，其余已凋谢时为止;单花花期以单花花瓣展开至花色由白转黄时为止。其中，开花进程分为5个过程，即始花期，开始开花;开花初期，开花量≤25%，其余未开放;开花中期，开花量≥50%，其余未开放;开花盛期，开花量≤25%，其余已凋谢;开花末期：开花量≤10%，其余已凋谢[10]。
　　1.2.2    花部结构。随机选择正常株和雄蕊退化株处于盛花期的各30朵海桐花，置于体视显微镜下观察记录海桐花的各个花部器官。使用游标卡尺测量花冠、花冠筒、花萼片、花瓣以及雌蕊、雄蕊等各部分花器官的直径或长度。记录下30朵海桐花部器官的数据后得出平均值与标准差，用于衡量海桐杂交指数。
　　1.2.3    花粉活力与柱头可授性。①花粉活力测定。海桐花粉活力测定采用TTC法，选择花蕾期（即将开放前，花瓣为白色）、开花第1天、开花第2天和开花第3天共4个阶段测定花粉活力。测定时，将未开放的花枝整枝摘下，置于自来水中水培，每天换水1次;每个时期于9：00—11：00随机选取5朵花，取花粉放置在玻片上，加0.5% TTC制成玻片，TTC溶液要求能够完全淹没花粉，然后将制好的玻片置于培养皿，并放入35 ℃恒温箱中，在黑暗条件下培养2 h，然后在光学显微镜下观察记录被染红的花粉比例，每个玻片记录6个视野，以平均值作为花粉活力。②柱头可授性测定。海桐柱头的可授性通过联苯胺-过氧化氢法（1%联苯胺∶3%过氧化氢∶水=4∶11∶22，体积比）来测定。测定时期选择同花粉活力测定。取以上各個时期海桐花的柱头，置于光学显微镜下，将柱头淹没在联苯胺-过氧化氢溶液中，如果柱头周围出现大量气泡，则表明海桐柱头具有可授性，反之无可授性;同时根据气泡的多少来衡量海桐花柱头可授性的强弱。
　　1.2.4    繁育系统。
　　（1）花粉/胚珠比。从种群中随机选取10个即将开放的健康花蕾，每个花蕾有5枚花药，取其中1枚花药的全部花粉粒，置于离心管中，加900 μL蒸馏水充分振荡使花粉分散均匀，取15 μL溶液，在4倍镜下统计全部花粉量，重复3次，然后计算平均花粉数。平均单花花粉数计算公式如下：
　　随机选取10个健康的花蕾，取子房置于显微镜下，用解剖刀切开心皮，记录总胚珠数，并计算平均单花胚珠数。按照 Cruden[11]的标准，植物繁育系统类型分为5种，即闭花受精、专性自交、兼性自交、兼性异交和专性异交。据此，以单花花粉数和胚珠数均值计算海桐花的花粉/胚珠比（P/O值），依据P/O值，评判海桐花的繁育系统类型。计算公式如下：
　　P/O值=平均单花花粉数/平均单花胚珠数
　　（2）杂交指数测定。海桐花杂交指数（OCI）的评判参考Dafni[9]的标准。随机选择30朵海桐花，一是测量花朵直径，以<1 mm、1～2 mm、2～6 mm、>6 mm为标准分别记为0、1、2、3;二是观察海桐花花药和柱头高度，高度一致记为0，否则记为1;三是记录雄蕊和雌蕊成熟顺序，雄蕊先熟记为1，否则记为0。杂交指数即为前3个指标总和，当其值为0、1、2时，则繁育系统分别评判为闭花受精、专性自交和兼性自交;当其值为3时，判断为自交亲和，有时需要传粉者;其值为4及以上时，则为部分自交亲和，异交需要传粉者。
　　（3）人工授粉试验。选择仍处于花蕾期并即将开放的花朵，对海桐花进行不同授粉处理，即自然授粉（对照）：只需挂好标签，不做其他处理;自动自花授粉：花前套袋，其他同自然授粉;人工授粉分为自花和异株异花2种，均做去雄套袋处理，并进行相应的人工授粉;无融合生殖做去雄套袋处理，其他同自然授粉。2周后统计不同处理的结果率。
　　结果率=结果数/处理单花数
　　采用Excel和SPSS软件对数据进行整理和分析。
　　2    结果与分析
　　2.1    开花物候
　　通过试验地观察，海桐于3月中旬开始开花，至4月中旬结束，群体花期约1个月。单花花期为（2.5±0.5）d，其形态过程如图1所示。
　　2.2    花部结构
　　海桐伞形花序或伞房状伞形花序顶生或近顶生，花气芳香浓郁，花蕾前期为浅绿色，即将开放前已逐渐转为白色，在盛开后又逐渐变为黄色至最终枯萎。花瓣及花药均为 5枚，离生;花梗长1～2 cm;萼片披针形，长4～5 mm;雄蕊2 型，花丝白色，正常雄蕊花药长圆形，黄色，退化雄蕊花药萎缩，棕褐色;子房卵形，侧膜胎座3个，胚珠15～22粒不等，2列着生于胎座中段;柱头成熟时会分泌黏液。海桐花梗、花萼片及子房壁均覆绒毛。对海桐的花部器官数据进行方差分析可知，海桐正常株和雄蕊退化株的花冠直径、花萼长和雄蕊长差异极显著（P<0.01），其余参数间差异不显著（P>0.05）（表1）。
　　2.3    花粉活力与柱头可授性 　　海桐在花蕾期花药就已经开裂，花蕾期花粉活力可达47.66%，但柱头可授性较低;花朵完全展开时，花粉活力最高，达到79.94%，柱头可授性也最强。随着花朵开放时间的延长，花粉活力也逐渐下降，开花第2天花粉活力为53.88%，至第3天时花粉活力下降至30.33%，柱头可授性也随之逐渐减弱（表2）。但在自然环境中，海桐花開花第1天花粉极易被昆虫带走，花朵会加速枯败，柱头接受花粉后也会加速花瓣和柱头的枯萎。
　　2.4    繁育系统
　　2.4.1    花粉胚珠比。海桐正常株单花花粉数均值为46 860.00±7 409.21，正常株和雄蕊退化株单花胚珠数均值分别为14.6±1.91和22.8.0±0.87，由此得出正常株的花粉胚珠比（P/O值）为3 209.59>2 588.00，依据Cruden[11]的标准，海桐的繁育系统为专性异交。
　　2.4.2    杂交指数。海桐花冠直径大小为9～12 mm。>6 mm，记为3;雌雄蕊同熟，记为0;柱头与花药位置不在同一高度（正常株花药高于柱头，雄蕊退化株花药低于柱头），记为1。由此得出OCI=4，按照Dafni的标准，可判断海桐繁育系统的类型为部分自交亲和，异交需要传粉者[8]。
　　2.4.3    人工授粉。由表3可知，在人工授粉试验中，海桐开花前套袋且不进行授粉处理和人工自花授粉处理的结果率均为0（n=30），表明海桐无自动自花授粉现象;对海桐进行去雄套袋处理，结果率为0（n=30），表明海桐不存在无融合生殖现象;海桐人工异株异花授粉的成功率较高，结果率为38.00%（n=50）;自然条件下，不进行任何处理，海桐也能授粉成功，但结果率较低，为11.38%（n=123）。可见，海桐的繁育系统为自交不亲和，是需要昆虫传粉的异交繁殖类型，且不存在自动自花授粉和无融合生殖。
　　3    结论与讨论
　　海桐于3月中下旬开始开花，群体花期约1个月;单花花期为（2.5±0.5）d，开放时间较短，且易受环境（温度、降雨等）影响。花初开放时花粉活力最高，为79.94%，同期柱头可授性也最强;当昆虫带走花粉后，其雄蕊和花瓣相比花粉未被带走的花更容易枯萎，同时引起花粉活力和柱头可授性的大幅度变化，故人工授粉应选择当天开放的花朵。此外，花粉活力测定有多种方法，不同方法对测定结果有一定影响[12]，可结合花粉离体萌发或MTT染色法等综合判断以得出更准确的结果。
　　花作为被子植物的繁殖器官，在植物生命史中具有重要地位[13]。植物在长期进化过程中为了满足繁殖的需求，其花部结构会随着自然条件的变化或传粉系统的选择等而发生变化[14-15]。海桐花具有雄蕊正常和雄蕊退化2种类型，雄蕊退化株的花冠直径更大、花萼更长、雄蕊更短，与海桐正常株存在极显著差异（P<0.01）。2种类型花冠大小和花萼长度的差异可能是植株对环境局部适应的结果，这在通泉草属植物中也有相似现象[16]，但也有研究证明花大小的变异相对于叶片等营养器官的变异性，更易受到传粉者的影响而非环境因素影响，且花冠大小与叶数量和两性资源配置也有一定关系[17-18]，故对海桐花2种类型出现花冠大小差异的原因还需进一步研究。退化雄蕊的形成则是植物在长期进化过程中自然选择的结果，在结构和功能上均具有多样性，与传粉方式和花结构关系紧密[19-21]。海桐雄蕊退化株的雄蕊极显著短于正常株雄蕊，花药败育，为棕褐色，包围在子房周围，推测其具有保护子房免受外来伤害以及避免自交的功能[20]，但海桐花雄蕊退化原因以及是否具有其他功能还需进行深入研究。
　　在本研究中，根据海桐的P/O值和OCI值可知，海桐的繁育系统为自交不亲和的专性异交类型，与人工授粉试验结果一致，且需昆虫为其传粉。植物的花部特征在很大程度上影响着繁殖的成功率[22]。海桐花同时大量开放，在顶端形成一片醒目的白色，且花香馥郁，这能增加其对于昆虫的吸引力[23-24]。海桐花粉具有活力与柱头具有可授性存在较多重合时间，正常株海桐花药为亮黄色，同一朵花花药通常同时散粉，花粉数量大，这些特征可使海桐获得更多的繁殖机会[25]。雄蕊退化株海桐则依靠更大的花冠、更白亮的花色等增加对昆虫的吸引力以获得外来花粉[26]，且其退化雄蕊低于柱头，柱头乳突更大、更明显，从而有利于柱头接受更多的花粉以完成授粉受精，增加繁殖机率[27-28]。正常株海桐存在雄蕊高于雌蕊，且开花时花药微向内凹对柱头形成包围状的自交优势，这也可能是形成雄蕊退化株型以避免自交的原因之一，而雌蕊与雄蕊处于隔离位以及自交的不亲和，也保证了海桐的异交繁殖[29]。根据套袋试验结果可知，海桐自交不亲和，而异交自然结果率较低（11.38%），人工异株异花授粉结果率也仅为38.00%，一方面可能是由于试验地海桐居群较小，同地同期开花植物较少，使得传粉昆虫种类和数量较少，进而影响了传粉效率和结果率;另一方面可能是由于单枝花序上花数量（>10朵）较多影响了海桐的资源配置，进而影响了结果率[30-31]，具体情况有待进一步研究。
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