一种苯醚氰菊酯胶体金免疫快速检测试纸条的研制

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　　摘要：通过制备苯醚氰菊酯半抗原，研制出一种能够检测蔬菜、水果中苯醚氰菊酯的胶体金免疫层析试纸条，检测限为1 μg/kg，检测时间仅为15 min，假阳性率和假阴性率均为0，符合《农残办技术材料要求及审查程序》要求，该试纸条能够应用到基层实验室的大批量样本检测，具有实际意义。
　　关键词：苯醚氰菊酯;胶体金免疫层析试纸条;快速检测
　　中图分类号：TS201.6;S482.3+5 文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）07-0196-03
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.07.040
　　Abstract： To establish a rapid assay for detection of cypermethrin in vegetables and fruit，and gold immunochromatography assay was studied. The limit of detection is 1 μg/kg. And we can obtain the results in 15 minutes. The assay gives no false positive and false negative results. The method is accurate，simple，reliable and convenient to rapidly detect cypermethrinon the spot.
　　Key words： cypermethrin; gold immunochromatography assay strip; rapid detection
　　苯醚氰菊酯屬于拟除虫菊酯类杀虫剂，拟除虫菊酯类杀虫剂是中国应用范围非常广泛的农药种类。苯醚氰菊酯分子式为C24H25NO3，作为新一代卫生杀虫剂，主要用于防治蚊蝇、蟑螂等害虫，低毒，目前研究报道较少，检测方法局限于高效液相色谱法等仪器方法[1-10]。仪器方法较难应用于基层实验室的大批量样本检测，苯醚氰菊酯胶体金免疫层析试纸条较好地解决了该问题。该试纸条能够检测蔬菜、水果中的苯醚氰菊酯农药残留，灵敏度较高，检测时间短，检测方便，是理想的初筛方法，并具有实际应用价值。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与仪器
　　苯醚氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等标准品（纯度≥95%）购自北京标准物质研究中心，氯金酸（HAuCl4·3H2O）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）均购自美国Sigma公司，柠檬酸三钠、碳酸钾购自北京百欣试剂公司;样本提取剂、样本复溶液、胶体金分析仪由北京勤邦生物技术有限公司提供;涡旋仪、均质器均购自湖南湘立科学仪器有限公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 苯醚氰菊酯半抗原的制备
　　1）取苯醚氰菊酯（化合物a）0.375 g，加四氢呋喃30 mL溶解，0～5 ℃搅拌20 min，加氢化铝锂0.11 g，恢复到室温，逐渐加热回流反应4 h。停止反应，加冰水30 mL，乙酸乙酯30 mL×3，萃取3次，合并有机相，蒸干，二氯甲烷/正己烷（V/V，1/10）80 mL重结晶，得到0.34 g产物化合物b，收率91.89%。
　　2）取0.34 g化合物b，加乙醇50 mL溶解，加1-甲酰基环丙烷-2-羧酸0.12 g，加三乙胺0.1 mL，室温搅拌8 h，转移到0～5 ℃搅拌10 min，加硼氢化钠0.11 g，继续搅拌1 h。反应停止，旋蒸蒸干，加水30 mL，乙酸乙酯30 mL×3，萃取3次，合并有机相，蒸干，上硅胶柱，二氯甲烷/甲醇（V/V，10/1）洗脱分离，得到0.38 g半抗原产物化合物d（图1），收率为88.37%。
　　1.2.2 免疫原的制备
　　1）苯醚氰菊酯半抗原与牛血清白蛋白（BSA）偶联物合成。取20 mg化合物d，加2 mL DMF溶解，加17 mg NHS、23 mg EDC，室温搅拌1 h，得到半抗原活化液A液，取BSA 100 mg，加0.05 mol/L PB缓冲液溶解，得到B液，将A液滴加到B液中，4 ℃搅拌过夜，0.02 mol/L PB缓冲液透析纯化，得到免疫原苯醚氰菊酯-BSA，-20 ℃保存，备用。
　　2）苯醚氰菊酯半抗原与卵清蛋白（OVA）偶联物合成。取12 mg化合物d，加2 mL DMF溶解，加11 mg NHS、17 mg EDC，室温搅拌1 h，得到半抗原活化液A液，取卵清蛋白80 mg，加0.05 mol/L PB缓冲液溶解，得到B液，将A液滴加到B液中，4 ℃搅拌过夜，0.02 mol/L PB缓冲液透析纯化，得到免疫原苯醚氰菊酯-OVA，-20 ℃保存，备用。
　　1.2.3 胶体金的制备 取0.01%氯金酸水溶液100 mL加热至沸腾;一边搅拌，一边加入1%柠檬酸三钠溶液1.5 mL;待氯金酸水溶液变为酒红色，继续煮沸15 min，冷却后，4 ℃避光保存。
　　1.2.4 苯醚氰菊酯单克隆抗体-胶体金标记物的制备 在磁力搅拌下，用0.2 mol/L Na2CO3溶液调节胶体金溶液pH至7.2，每毫升胶体金溶液中加入50 μg苯醚氰菊酯单克隆抗体，混匀，静置10 min，加入10% BSA，使其在胶体金溶液中的体积百分含量为1%，静置10 min。离心、洗涤、重悬，置4 ℃备用。
　　1.2.5 标记物冻干 将100 μL苯醚氰菊酯单克隆抗体-胶体金标记物加入到微孔板中，置于冷冻干燥机，冷阱温度为-50 ℃，预冻3 h，再真空干燥15 h，即得到苯醚氰菊酯单克隆抗体-胶体金标记物冻干的微孔试剂。 　　1.2.6 检测方法 向微孔中加入100 mL待检样本溶液，混匀，室温下孵育3 min，吸取70 mL滴至试纸条上，反应10 min，根据图2判定结果或通过胶体金分析仪读取检测结果。其他时间判读无效。
　　1.2.7 样本检测限 在空白蔬菜、水果样本中分别添加苯醚氰菊酯标准品至质量浓度为0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 μg/L，按照“1.2.6”用3批试纸条进行检测，每个浓度重复5次，根据试验结果确定样本检测限。
　　1.2.8 试纸条的检测
　　1）特异性。分别配制500 μg/L氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等药物，用此试纸条检测，重复3次，判断试纸条的特异性。
　　2）准确性。农业农村部文件要求：以假阳性率和假阴性率表示胶体金免疫层析法的准确性。取经仪器确证的50份阴性蔬菜、水果样品（质量浓度小于1 μg/kg），50份阳性蔬菜、水果样品（质量濃度大于1 μg/kg），用该试纸条检测苯醚氰菊酯药物残留，计算假阳性率和假阴性率。《农残办技术材料要求及审查程序》规定：试纸条假阳性率应小于5%，假阴性率应为零。
　　3）稳定性。将试纸条保存于2～8 ℃环境中，每隔1个月检测试纸条的准确性，连续测定15个月。具体方法为：分别检测经仪器确证的20份阴性蔬菜、水果样品（质量浓度小于1 μg/kg），20份阳性蔬菜、水果样品（质量浓度大于1 μg/kg），重复测定2次，根据试验结果判定试纸条的稳定性。
　　2 结果与分析
　　2.1 胶体金的鉴定
　　肉眼观察制备的胶体金，其颜色为酒红色、均匀度较好、无杂质、透明度较高。取冷却后的胶体金溶液在透射电镜下观察胶体金颗粒的均一程度，测量胶体金颗粒粒径，经透射电镜观察，胶体金颗粒分布较均匀，粒径为20 nm左右（图3）。
　　2.2 样本检测限
　　配置苯醚氰菊酯浓度分别为0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 μg/L的蔬菜、水果样品进行检测，确定检测限。该试纸条的检测限为1 μg/kg，结果见表1、图4、图5。
　　2.3 特异性
　　该试纸条检测500 μg/L的氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等药物，结果均呈阴性，表明该试纸条特异性较好（表2）。
　　2.4 准确性
　　用该试纸条检测50份阴性蔬菜、水果样品，检测结果均为阴性，说明假阳性率低于5%;用该试纸条检测50份阳性蔬菜、水果样品，试纸条检测结果均为阳性（表3），说明试纸条假阴性率为零，符合《农残办技术材料要求及审查程序》要求。
　　2.5 稳定性
　　12个月内，试纸条的假阳性率和假阴性率均符合要求，从第13个月起，试纸条会出现少量失效、假阴性等现象（表4）。
　　3 讨论
　　目前，有关检测苯醚氰菊酯的文献非常有限，通过制备苯醚氰菊酯半抗原，让其与载体蛋白偶联得到免疫原，最终制备出商品化的胶体金免疫层析试纸条。按照《农残办技术材料要求及审查程序》要求，对试纸条进行了特异性、准确性、稳定性等性能测试，均符合要求。试纸条的检测时间仅为15 min，检测限为1 μg/kg，比现有文献中仪器方法用时更短，操作更简便。
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