正交法优化黄精地上茎叶中有效成分的提取工艺

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　　摘要：以黄精（ Polygonatum sibiricum）地上部莖叶为试材，采用单因素试验研究了料液比、提取温度、提取时间和乙醇体积分数对提取黄酮、多酚和多糖得率的影响。通过正交试验优化黄酮、多酚和多糖的提取工艺。结果表明，提取黄酮最佳条件为提取温度70℃，料液比1：80，提取时间2.5 h，乙醇体积分数为90%，黄酮平均得率为4.01%;提取多酚最佳条件为料液比1：40，提取温度80℃，提取时间1.0 h，乙醇体积分数为60%，多酚平均得率为0.62%;提取多糖的最佳条件为提取温度80℃，料液比1：20，提取时间2.0h，多糖平均得率为18.61%。验证试验表明，这3种优化工艺稳定可行。
　　关键词：黄精（Polygonatum sibiricum）;黄酮;多糖;多酚;优化;提取工艺;正交试验
　　中图分类号：R282
　　文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（ 2020） 12-0139-06
　　D01：10.1408 8/j .cnki.issn043 9- 8114.2020.12.031
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　黄精（Polygonatum sibiricum）为百合科（Liliace-ae）黄精属（Polygonatum）草本植物，根茎横走，圆柱状，结节膨大，叶轮生，无柄，目前已知的黄精药材种类有3种，包括滇黄精、黄精和多花黄精[1]。黄精是药食同源植物之一，其味甘、性平，具有润肺、补气、益肾补精，延年益寿、降血糖血压等作用，长期服用可以改善人的体质[2]。一般黄精加工和利用的部位是地下的块茎，对于地上部分的茎、叶开发利用的较少。通过预试验得知，其地上茎叶也含有黄酮、多酚和多糖等活性成分，因此为了充分利用黄精原材料，使地上茎叶变废为宝，本试验通过正交法优化黄精地上茎叶中有效成分的提取工艺，从而提高黄精的综合开发利用率。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　黄精采自湖北省恩施州恩施市大地生物研究所黄精科研基地，试验所用材料为黄精的地上部分（茎、叶）。
　　1.1.1 试剂与仪器 主要试剂：芦丁、苯酚、石油醚、浓硫酸、硝酸铝、碳酸钠、亚硝酸钠、无水乙醇、去离子水、氢氧化钠、没食子酸、葡萄糖标准品、Foline-phenol试剂。所有试剂为分析纯，蒸馏水为双蒸水。
　　主要仪器：DZF-6090真空干燥箱、DFY-500摇摆式高速万能粉碎机、HWS12电热恒温水浴锅、TDL-80-2B低速台式离心机、冷冻离心机、TU-1810紫外可见分光光度计、FA-1004B电子分析天平。
　　1.1.2材料的预处理将新鲜黄精的地上部分（茎和叶）分别用自来水洗净，再用双蒸水冲洗2-3次，晾干后切碎，于60℃烘箱中烘至恒重，用粉碎机磨成粉末，过60目筛，将制成的粉末用石油醚按照料液比1：2（g/mL）进行脱脂，浸泡ld后回收石油醚，接着将粉末重新置于60℃烘箱中烘至恒重，装于试剂瓶中，贴上标签，置于干燥器内贮存备用。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 提取工艺流程药材脱脂一热水浸提一离心一收集上清液一浓缩一活性炭除色素一醇沉一离心，取部分上清液减压浓缩后冷冻干燥，得到黄酮粗提物（提取多酚工艺流程同上），取沉淀物溶于水中，即得到黄精多糖的粗提物。
　　1.2.2 标准曲线制作及含量测定采用亚硝酸钠一硝酸铝一氢氧化钠络合分光光度法测定黄酮的含量[3|。以芦丁浓度为横坐标（x），芦丁溶液吸光度为纵坐标（y）绘制标准曲线，获得线性回归方程y=8.687 5x-0.057 I（R2=O.ggg 7）。采用Folin-Ciocalteu法测定多酚的含量[4]。以没食子酸的体积分数作为横坐标（x），没食子酸的吸光度作为纵坐标（y）绘制标准曲线，标准曲线为y=104.7x+0.000 5（R2=0.999 3）。采用苯酚一硫酸法测定多糖的含量[5]。以标准葡萄糖浓度为横坐标（x），标准葡萄糖溶液吸光度为纵坐标（y）绘制标准曲线，回归方程为y=10.506x+0.001 6（R2=0.999 5）。
　　含量计算公式：得率=（Nx VxClm） x100%，式中，Ⅳ为稀释倍数，y为样品溶液的最终稀释体积（mL），C为样品溶液中有效成分的质量浓度（ mg/mL），m为药材质量（mg）。
　　1.2.3 单因素试验
　　1）料液比。
　　黄酮：精确称取待测样品1.0 g，设置料液比为1：20、1：40、1：60、1：80、1：100，每组重复3次，固定乙醇体积分数为60%，提取温度80℃、提取时间1.0 h，提取2次，得到最佳料液比。
　　多酚：设置料液比为1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70，每组重复3次，固定提取温度70℃，乙醇体积分数为50%，方法同上。
　　多糖：设置料液比为1：10、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40，无水乙醇溶液，其余条件同上。
　　2）提取温度。
　　黄酮：精确称取待测样品1.0 9，设置温度为40、50、60、70、80、90、100℃，每组重复3次，固定乙醇体积分数为60%，料液比1：80，提取时间1.0 h，试验提取2次，得到最佳提取温度。
　　多酚：设置温度为30、40、50、60、70、80、90、100℃，固定料液比1：50，方法同上。
　　多糖：设置温度为40、50、60、70、80、90℃，固定料液比1：20，无水乙醇溶液，其余条件同上。
　　3）提取时间。
　　黄酮：精确称取待测样品1.0 9，设置提取时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，每组重复3次，固定乙醇体积分数为60%，料液比1：80，提取温度80℃，试验提取2次，得到最佳提取时间。 　　多酚：设置提取时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，固定料液比1：50，提取温度70℃，乙醇体积分数50%，方法同上。
　　多糖：设置提取时间为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，料液比1：20，无水乙醇溶液，其余条件同上。
　　4）乙醇体积分数。
　　黄酮：精确称取待测样品1.0 9，乙醇体积分数为40%、50%、60%、70%、80%、90%、l00%，每组重复3次，固定料液比1：80，提取时间1.0 h，温度80℃，试验提取2次，得到最佳乙醇体积分数。
　　多酚：乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，固定料液比1：50，提取时间1.0 h，温度70℃，方法同上。
　　1.2.4正交试验设计正交试验设计因素与水平如表1所示。
　　2 结果与分析
　　2.1 单因素试验结果分析
　　2.1.1料液比对黄精有效成分得率的影响 由图1可知，料液比从1：20到1：100时，黄精茎叶中黄酮得率呈逐渐增长趋势;当料液比达到1：80后，黄酮得率趋于平稳。原因可能是当料液比在1：80时，黄精中黄酮得到最大程度的溶解。试验结果表明（图2），料液比为1：20-1： 50时，黄精多酚得率呈增长趋势;当料液比超过1：50后，多酚得率逐渐平稳。原因可能是当料液比在1：50时，黄精多酚已经达到最大程度的溶解。由图3可知，料液比为1：10-1：20时，黄精茎叶中多糖得率呈上升趋势;当料液比超过1：20后，多糖得率增長变得稳定，原因可能是随着料液比的上升，样品中的多糖已经全部溶解在提取液中。
　　2.1.2提取温度对黄精有效成分得率的影响 由图4可知，温度在40-70℃，随着温度的升高，黄精茎叶中黄酮得率呈上升趋势;在温度到达70℃后，其得率呈下降趋势。原因可能是温度较低时黄酮不能充分溶出，温度过高会破坏黄酮的结构。试验结果（图5）显示，温度在30-70℃，随着温度的升高，多酚得率呈上升趋势;在温度达到70℃后，其得率基本呈下降趋势。原因可能是温度较低时多酚不能充分溶出，温度过高会破坏多酚的结构。由图6可知，温度在40-80℃，随着温度升高，多糖得率呈上升趋势;温度超过80℃时，其得率呈下降趋势，原因可能是高温条件下多糖结构被破坏。
　　2.1.3提取时间对黄精有效成分得率的影响 由图7可知，提取时间在0.5-1.5 h，随着时间推移，黄精茎叶中黄酮得率呈上升趋势;提取时间在1.5-2.5 h，其得率呈下降趋势。原因可能是提取时间过长，导致黄酮结构被破坏。由图8可知，在提取时间在0.5-1.5 h，随着时间推移，多酚得率逐渐升高，提取时间在1.5-3.0 h，其得率呈下降趋势。原因可能是提取一定时间后，多酚已被最大限度地提取完成，时间再延长，只能增加多酚的氧化和破坏。由图9可知，提取时间在1.0-2.0 h，随着时间的推移，多糖得率呈上升趋势;提取时间在2.0-4.0 h，其得率呈下降趋势;提取时间在4.0-5.0 h，其得率趋于平稳。原因可能是样品中水溶性多糖大约在2.0 h处已完全溶解，随后出现下降趋势，可能是提取时间过长，导致部分水溶性多糖的糖链断裂，最终趋于平稳。
　　2.1.4 乙醇体积分数对黄精有效成分得率的影响由图10可知，乙醇体积分数在40% -90%时，黄酮得率呈持续上升趋势;乙醇体积分数超过90%后，其得率明显下降。由图11可见，乙醇体积分数在30% -50%时，多酚得率呈持续上升趋势;乙醇体积分数超过50%后，其得率呈下降趋势。
　　2.2 正交试验结果分析
　　2.2.1 正交试验结果表2、表3和表4分别为黄精地上部分的黄酮、多酚和多糖提取的正交试验结果。在正交试验中，黄精地上部黄酮最高得率为3.91%，此时提取条件为A3B2C4D3，即料液比1：80，提取温度70℃，提取时间2.5 h，乙醇体积分数为90%。黄精多酚最高得率为0.57%，此时提取条件为A283CID3，即料液比1：40，提取温度80℃，提取时间1.0 h，乙醇体积分数为60%。黄精多糖最高得率为18.55%，此时提取条件为A2B2C2，即料液比1：20，提取时间2.0 h，提取温度80℃。
　　2.2.2 方差分析从表5可知，料液比对黄酮和多糖得率影响不显著，但对多酚得率有显著影响;提取温度对黄酮得率的影响不显著，但对多糖得率和多酚得率有极显著和显著影响;提取时间对黄酮和多酚得率影响不显著，但对多糖的得率有显著影响;乙醇体积分数对黄酮和多酚得率有显著影响;4个因素对黄精黄酮得率的影响大小顺序为D>C>B>A，对黄精多酚得率的影响顺序为A>B>D>C，对多糖得率的影响顺序从高到低为B>C>A。
　　2.2.3 验证试验分别称取黄精样品粉末1.0 g，在对应工艺条件下进行验证试验，提取黄酮的条件为料液比1：80，提取温度70℃，提取时间2.5 h，乙醇体积分数90%;提取多酚的条件为料液比1：40，提取温度80℃，提取时间1.0 h，乙醇体积分数60%;提取多糖的条件为料液比1：20，在80℃水浴锅中水浴2.0 h，平行试验3次。黄精黄酮得率为4.01%，多酚平均得率为0.62%，大于正交试验结果，多糖平均得率为18.61%，与正交试验中的最大得率相近，即该最佳提取工艺稳定可行。
　　3 小结与讨论
　　经过正交试验优化了黄精茎叶中黄酮的提取工艺，得到最佳提取工艺条件为料液比1：80，提取温度70℃，提取时间2.5 h，乙醇体积分数90%，该条件下黄酮得率为4.01%。试验最终结果为进一步开发利用黄精茎叶中的黄酮提供了可行的方法。李莺等[6]认为黄酮类化合物可能是黄精发挥多种药理作用的活性因子。本试验中黄精茎叶中黄酮的含量相对较高，可以加大对黄精茎叶中黄酮的开发力度。通过正交试验优化了黄精茎叶中多酚的提取工艺，得到最佳提取工艺条件为料液比1：40，提取温度80℃，提取时间1.0 h，乙醇体积分数60%，该条件下多酚得率为0.62%。李涛等[7]对苹果渣多酚的提取分离技术进行了研究，得出在最佳提取工艺下得率为0.121%。李椒等[8]对菠萝皮渣多酚提取工艺进行了研究，得出在最佳提取工艺下得率为0.777%。魏璐[9]对玉米花丝多酚提取技术进行了研究，得出在微波最佳提取工艺下得率为0.599%。巫永华等[10]对黄精块茎中多酚提取工艺进行了研究，得出在最佳提取工艺下得率为0.478 8%。因此，对比黄精块茎和其他植物中的多酚含量，黄精地上部多酚含量处于较高水平。通过正交试验优化了黄精茎叶中多糖的提取工艺，获得最佳提取工艺条件为料液比1：20，提取温度80℃，提取时间2.0 h，该条件下多糖得率为18.61%。
　　参考文献：
　　[1]中华人民共和国卫生部药政管理局中国药品生物制品检定所，现代实用本草[M].北京：人民卫生出版社，1997.721.
　　[2]田启建，赵致.黄精属植物种类识别及资源分布研究[J].现代中药研究与实践，2007（1）：18-21.
　　[3]李奎，李雪玲.响应面法优化碱液提取百蕊草多糖的工艺研究[J].食品工业科技，2015（7）：204-207，213.
　　[4]曹增梅，黄和.超声波辅助提取番石榴中多酚类物质的研究[J].食品与机械，2012（5）：25-26.
　　[5]江念，万佐玺，郑小江，等.正交试验法优化3种乌蔹莓属植物中黄酮和多糖的水提醇沉工艺[J].中成药，2016（IO）：2281-2284
　　[6]李莺，赵兵，陈克克，等，黄精的研究进展[J].中国野生植物资源，2012，31（1）：9-13.
　　[7]李涛，苹果渣中多酚的提取分离技术研究[D].陕西杨凌：西北农林科技大学，2007.
　　[8]李俶，沈佩仪，吴华星，等.Hartley方法优化菠萝皮渣多酚化合物提取工艺[J].食品科学，2011，32（4）：131-134.
　　[9]魏璐，玉米花丝多酚提取纯化及鉴定技术研究[D].长春：吉林大学，2014.
　　[10]巫永华，刘恩岐，张建萍，等，黄精多酚的闪式提取及抗氧化活性研究[J].食品科技，2017，42（8）：231-236.
　　基金项目：恩施州科技研究与开发项目（ XYJ2018000013）;湖北民族大学2019年大学生创新训练计划项目;湖北省教育厅科学技术研究项目（ D20141903）
　　作者简介：杨泽娃（1998-），女，湖北荆州人，在读本科生，研究方向为生物科学，（电话）15172873623（电子信箱）526481778@qq.com;通信作者，武芸（1971-），女，副教授，硕士，主要从事天然产物研究与开发，（电话）18872785678（电子信箱）13560177516@qq.com。
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