干燥温度对苜蓿草种子活力的影响研究

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　　摘要    种子在干燥过程中随着温度的变化会出现老化现象，导致生理特性发生改变和种子活力下降，进而降低种用价值。为探讨干燥温度对苜蓿种子活力的影响，选择不同干燥温度对苜蓿种子进行干燥，分别测定了发芽率、发芽势、抗氧化酶活性、代谢酶活性及有害物质丙二醛的含量。结果表明，当干燥温度为35 ℃时，种子发芽率和发芽势最高，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性显著高于其他干燥温度，丙二醛含量显著低于其他干燥温度，脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶活性显著高于其他干燥温度。干燥温度为35 ℃时有利于苜蓿种子的干燥，并且能够明显提高种子活力。本研究结果能较好地说明不同干燥温度对苜蓿种子活力的影响，为实际生产中苜蓿草种子的干燥提供了一定的参考。
　　关键词    苜蓿种子;干燥温度;种子活力;抗氧化酶;代谢酶
　　中图分类号    S551+.7        文献标识码    A
　　文章编号   1007-5739（2020）17-0206-04                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）
　　Abstract    During the drying process， the seeds will age with the change of temperature， which leads to the change of physiological characteristics and the decrease of seed vigor， thus reducing the value of seed. In order to investigate the effect of drying temperature on the vigor of alfalfa seeds， different drying temperatures were selected to dry the alfalfa seeds， and the germination rate， germination potential， antioxidant enzymes activity， metabolic enzymes activity and harmful substances malondialdehyde contents were determined. The results showed that when the drying temperature was 35 ℃， the seed germination rate and germination potential were the highest， superoxide dismutase （SOD） and catalase （CAT） activity were signifi-cantly higher than other drying temperatures， and the malondialdehyde content was significantly lower than other temperature. The activity of lipase， protease， and amylase were significantly higher than other drying temperatures. The drying temperature of 35 ℃ was conducive to the drying of alfalfa seeds， and could significantly improve seed vigor. The results of the study can better explain the effects of different drying temperatures on the vigor of alfalfa seeds， and provide references for the drying of alfalfa seeds in actual production.
　　Key words    alfalfa seed; drying temperature; seed vigor; antioxidase; metabolic enzyme
　　苜蓿（Medicago sativa L.）作為世界上最重要、种植最广泛的豆科牧草之一，具有适应性广、产草量高的特点，同时富含蛋白质、维生素、矿物质以及氨基酸，是家畜的主要饲料来源，被誉为“牧草之王”[1-4]。苜蓿栽培历史悠久，经济价值高，而且种质资源丰富，文献记载的苜蓿品种达46个[5]。苜蓿能够提高土壤肥力和保持水土的能力，具有重要的经济与生态功能[6-8]。
　　然而，苜蓿种子在采集后由于自身含水量较高，若不及时进行干燥处理将会导致种子霉变甚至腐烂，导致品质下降，影响种子活力。同时我国对苜蓿产品需求量巨大，导致苜蓿种植面积进一步扩大，因而苜蓿良种的缺乏已经对苜蓿生产造成一定限制[9]。因此，对种子及时进行干燥处理，防止出现发霉变质，保持种子活力，延长种子的储藏期限，保护现有种子资源十分有必要[10]。加强苜蓿草种子干燥处理，防止种子霉变变质和保持种子的良好活力具有重要意义。目前，对干燥温度对苜蓿种子活力影响的研究相对较少，研究的广度和深度需要进一步扩展。本研究以苜蓿种子为研究对象，通过不同温度对苜蓿种子进行干燥处理，进而检测种子活力及相关酶活性的变化，探究不同干燥温度对苜蓿种子活力的影响，为苜蓿种子的采后干燥研究提供一定的理论基础。 　　1    材料与方法
　　1.1    試验材料
　　苜蓿种子（2019年9月采集于内蒙古呼伦贝尔草原，为呼伦贝尔杂花苜蓿，种子初始含水量为12.1%）;次氯酸溶液（分析纯，上海阿拉丁公司）;三氯乙酸，福林-酚试剂，国药集团上海化学试剂公司;蒸馏水，实验室自制。BCA蛋白试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、过氧化物酶（POD）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、脂肪酶试剂盒、淀粉酶活性测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。
　　AR124CN电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司;DHG-9070电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司;恒温恒湿培养箱，北京恒诺利兴科技有限公司;Biomate3S紫外分光光度计，美国热电公司;SpectraMaxiD3酶标仪，美谷分子仪器有限公司。
　　1.2    试验设计
　　参考赵玉文等[11]研究方法对采集的苜蓿种子进行预处理，去除杂质，弃去虫蚀、干瘪、成熟度低的种子。准确称取10 g种子于不同温度（25、30、35、40、45、50、55 ℃）下进行干燥，每隔20 min进行称重并计算种子水分损失量，以8%为种子最终含水量绘制种子水分损失曲线[12]，对烘干后的种子进行发芽率和发芽势测定，根据测定结果筛选特定温度干燥的种子进行抗氧化酶和代谢酶活性的测定。
　　1.3    试验方法
　　1.3.1    待测液的制备。准确称取1 g烘干后的苜蓿种子于预冷研钵中，按照1∶9的比例加入生理盐水，冰浴条件匀浆后于2 500 r/min条件下离心10 min，取上清液用生理盐水按1∶9的比例稀释成1%组织匀浆，作为待测液。
　　1.3.2    种子萌发测定。选取优质苜蓿种子用0.6%次氯酸钠溶液浸泡15 min，纯水冲洗去除残留消毒液，用吸水滤纸将种子表面的水分吸干。计数100粒放入铺有双层滤纸（直径9 cm）塑料培养皿中，3次重复，然后放入恒温光照培养箱中，设置温度为25 ℃、湿度为80%、光照间隔12 h，进行发芽试验。参考王晓龙等[9]方法进行发芽率和发芽势测定。
　　1.3.3    蛋白含量的测定。苜蓿种子中蛋白质含量采用BCA法进行测定，按照南京建成科技有限公司生产的BCA蛋白质含量测定试剂盒说明书操作进行测定。
　　1.3.4    抗氧化酶活性测定。不同干燥温度下干燥的苜蓿种子中SOD、MDA、POD和CAT活性分别采用羟胺法、TBA法、比色法进行测定，按照试剂盒说明书进行操作。
　　1.3.5    代谢酶活性测定。脂肪酶、淀粉酶活性采用试剂盒并按照说明书操作进行测定并计算分析。蛋白酶活性测定采用Folin-酚法测定[13]，酶待测液在水浴锅40 ℃预热，然后取1 mL酶溶液和等体积的酪蛋白底物溶液（2%）混合均匀。在40 ℃水浴锅中放10 min后加入2 mL三氯乙酸（0.4 mol/L），静置10 min过滤，取1 mL滤液加5 mL Na2CO3溶液（0.4 mol/L），随后加入1 mL Folin-酚试剂摇匀，水浴锅保温20 min，冷却30 min后在波长680 nm处测定吸光值。对照组先加入三氯乙酸溶液使酶失活再加入底物溶液。蛋白酶活力根据酪氨酸标准曲线计算，以单位时间单位鲜重产生1 μg酪氨酸为1个酶活力单位[U=μg/（g FW·min）]。蛋白酶活力按照下列公式计算：
　　式中，C为酪氨酸浓度;Vt为酶液体积（mL）;FW为样品鲜重（g）;T为反应时间（min）;Vs为反应酶液体积（mL）。
　　1.4    数据分析
　　试验中数据结果均表示为平均值±标准偏差，3次重复。采用Excel 2016软件处理数据，Origin和SPSS 21.0统计软件进行绘图和统计分析及差异性检验，P<0.05认为具有显著性差异。
　　2    结果与分析
　　2.1    不同干燥温度下水分损失情况
　　如图1所示，苜蓿种子中的水分含量随着干燥时间的延长逐渐减少，不同干燥温度到达种子标准含水量的时间也不同，适宜的干燥温度需要结合后续发芽率等相关试验结果进行综合评价。
　　2.2    不同干燥温度下苜蓿种子发芽率
　　由图2可以看出，不同干燥温度下苜蓿种子的发芽率存在显著性差异。温度低于35 ℃时，苜蓿种子的发芽率均低于80%;当温度为35 ℃时，苜蓿种子发芽率和发芽势达到最大值，显著高于其他温度下的发芽率和发芽势。因此，干燥温度为35℃时有利于种子的萌发。
　　2.3    不同干燥温度下苜蓿种子蛋白质含量变化
　　如图3所示，不同干燥温度对种子蛋白质含量有一定的影响。25 ℃（室温）和30℃条件下，种子蛋白质含量没有明显差别（P>0.05），温度为35 ℃，种子蛋白质含量显著高于其他组别（P<0.05）。温度为55 ℃，种子蛋白质含量显著低于其他各温度，究其原因可能是干燥温度较高对蛋白质造成了一定的影响。35 ℃时种子蛋白质含量最高，对保证种子正常萌发、提高种子活力有着重要作用。
　　2.4    不同干燥温度下苜蓿种子抗氧化酶活性
　　如图4所示，不同干燥温度对苜蓿种子抗氧化酶活性有着一定的影响。对于超氧化物歧化酶（SOD），温度的升高导致其活性上升，当温度为35℃时，酶活性显著高于其他温度（P<0.05）。对于过氧化物酶（POD）的活性，25、30、35 ℃酶活性变化不明显，温度为55 ℃时，过氧化物酶活性显著高于其他温度（P<0.05）。对于过氧化氢酶（CAT）的活性，当温度为35 ℃时酶活性显著高于其他温度（P<0.05）。当温度为35 ℃时丙二醛（MDA）含量显著低于其他温度（P<0.05）。当温度为35 ℃时，苜蓿种子中SOD和CAT活性最高，POD活性与室温干燥活性没有明显差别，MDA含量显著低于其他温度。综合考虑，35 ℃对于种子中部分抗氧化酶活性的提高有着促进作用，有利于保持苜蓿种子活力。 　　2.5    不同干燥温度下苜蓿种子代谢酶活性
　　如图5所示，不同的干燥温度对苜蓿种子中各种代谢酶活性有一定的影响。脂肪酶活性随着温度的升高呈现上升趋势，温度超过35 ℃，活性下降。淀粉酶活性随着温度升高至35 ℃，酶活性达到最高。蛋白酶活性随着温度的升高呈现上升趋势，温度超过35 ℃时，活性下降。当干燥温度为35 ℃时，各种代谢酶活性最高，这表明35 ℃的干燥温度对于苜蓿种子中淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性的提高有一定促进作用， 有利于提高种子活力，加快种子的萌发。
　　3    结论与讨论
　　种子是植物生长的基础材料，种子的活力与种子萌发有着密切的联系，同时也关系到牧草业发展的基础环节，种子萌发易受到硬实、种子质量、种子活力、病害及环境因素的影响。当苜蓿种子含水量超过13%时要进行干燥处理，降低自由水含量使种子进入静止或者休眠状态，有利于种子活力的延长和种子寿命的保持，同时对于种子中杂质和尘土也需进行清选，以避免杂质对种子质量造成影响[14-15]。因此，对收获的种子进行干燥处理是十分有必要的。
　　苜蓿作为我国重要的经济牧草，在我国畜牧业发展中有着重要的地位。我国畜牧业的快速发展对苜蓿产品需求量巨大，导致苜蓿种植面积也在進一步扩大。因此，苜蓿良种的缺乏已经对苜蓿生产造成一定限制，加强对现有苜蓿草资源的保护十分有必要。本研究中探讨了不同干燥温度对苜蓿种子活力的影响，结果显示，不同干燥温度对种子的发芽率和发芽势有一定的影响;干燥温度为35 ℃时，种子发芽率和发芽势明显高于其他温度，这表明35 ℃有利于种子萌发。干燥温度过高或者过低都会影响种子发芽率和发芽势，这可能与温度影响萌发相关酶的活性有关，种子各种酶的最适酶活都有适宜的温度[16]。
　　种子中重要的营养物质主要有蛋白质、淀粉和脂肪。蛋白质作为种子发育过程中重要的贮藏物质，其在种子休眠、萌发、幼苗早期生长发育过程中扮演着重要的角色[17]。因此，对不同温度下种子中的蛋白质含量进行测定很有必要。试验结果表明，不同的干燥温度对蛋白质含量有着一定的影响，35 ℃时蛋白质含量最高，可见35 ℃对于种子萌发的营养供给有着促进作用。
　　种子的代谢强度与其细胞膜系统的完整性有关。膜系统常因过氧化作用而受到伤害，细胞内的过氧化物酶具有清除自由基、降低活性氧、防止过氧化作用的功能，免受膜损伤，对于维持种子中抗氧化系统稳定性方面有着重要作用[18-19]。因此， 抗氧化酶活性对种子的活力及正常萌发有着重要的作用。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是细胞内清除活性氧的主要酶类，试验结果表明，不同温度对种子内抗氧化酶活性有着明显的影响，35 ℃时各种抗氧化酶活性均最高，MDA含量最低，究其原因可能是温度的升高进而造成细胞膜结构功能受到破坏，使细胞完整性丧失，进而导致细胞内电解质渗漏和MDA积累，导致种子质量下降。当温度为35 ℃时MDA含量最低，可能与种子内抗氧化酶（CAT、SOD 等）有效消除活性氧自由基有关[20]。在较低温度（25、30、35 ℃）时，过氧化物酶活性没有显著区别，55 ℃时活性最高。不同酶有不同的最适温度。综合考虑，当温度为35 ℃时，苜蓿种子中抗氧化酶活性最高，对于种子中的活性氧有着良好的清除作用，有利于保持苜蓿种子的活力。
　　种子中重要的储能物质包括糖类、蛋白质和脂肪。主要的贮藏物质是糖类，为种子的生命活性提供呼吸基质，保证呼吸作用正常进行。脂类可以抑制种子的透水性进而对细胞膜进行保护，对于维持种子细胞内各项生命活动的正常进行有着重要作用。蛋白质作为构成细胞结构的主要有机物，也为种子的正常代谢和发育提供氮来源[21-24]。淀粉和蛋白质作为苜蓿种子中的主要有机物，在种子萌发时被各种代谢酶（淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶）水解为简单的有机物，为种子的正常萌发提供营养物质[25]，是种子萌发过程中重要的酶类。因此，代谢酶活性的大小关系到种子萌发的质量和速度。淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶是催化水解淀粉、脂肪和蛋白质的主要酶类，其活性大小会影响到淀粉、蛋白和脂肪的水解程度，进而影响种子的生长过程。本文试验结果中，不同的干燥温度对代谢酶的活性有着一定的影响，当温度为35 ℃时，各种代谢酶活性均最高，显示该温度可提高种子各代谢酶活性，表明35 ℃有利于提高代谢酶活性，进而提高种子萌发时的营养供给，提高种子活力。当干燥温度为35 ℃时，种子发芽率最高，达到84%，发芽势达到75%。抗氧化酶活性也较高，有利于种子的萌发。本文仅从蛋白质水平研究了干燥温度对苜蓿种子活力的影响，相关的分子机理还需要进一步探究。
　　4    参考文献
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