啤酒酵母基因工程菌种的构建方法研究现状与应用

来源:用户上传      作者:于洪梅

　　摘  要：啤酒酵母的质量控制决定了啤酒的质量，基因工程育种技术具有定向性，可以对啤酒酵母进行育种、改良及风味改进。利用基因工程技术，在不改变酵母原有特性的基础上，能赋予酵母新的特性。可以有效利用麦芽汁中的营养物质，降低不利的副产物生成量，改良发酵性能等。该文简述基因工程育种的主要方法及在啤酒酵母育种中的应用情况。
　　关键词：啤酒酵母  基因工程  育种  菌种
　　中图分类号：TS262                           文献标识码：A文章编号：1672-3791（2020）12（c）-0044-03
　　Research Status and Application of Genetically Engineered Strains of Beer Yeast
　　YU  Hongmei
　　（Changchun Vocational Institute of Technology， Changchun， Jilin Province，130033  China）
　　Abstract： The genetic engineering breeding technology is directional and can be used to breed and improve the beer yeast and make the flavor of beer yeast better. Using genetic engineering technology， the yeast can be given new characteristics without changing the original characteristics of the yeast. This article briefly describes the main methods of genetic engineering breeding and its application in beer yeast breeding.
　　Key Words： Beer yeast; Genetic engineering; Breeding; Strain
　　酵母是一种单细胞真菌微生物，已知的种类约有56属500多种[1]。啤酒酵母是啤酒酿造的灵魂，啤酒的风味主要由啤酒酵母代谢产生的风味物质综合形成，风味稳定性是啤酒最重要的质量指标之一[2]，啤酒酵母的质量控制决定了啤酒的质量[3]。因此，选育性能优良的啤酒酵母，是啤酒生产企业长期而艰巨的任务。微生物育种的方法有很多，随着DNA重组技术的发展，啤酒酵母的定向育种迅速发展起来。基因工程技术包括杂交、细胞融合、稀有交配、转化、突变、DNA重组技术等，近年来，多株Lager酵母菌株陆续完成了全基因组测序，为探索不同类型Lager酵母起源提供了基因组学基礎[4]。利用基因工程技术，可以对啤酒酵母进行育种、改良及风味改进。该文主要介绍基因工程菌种的构建方法及在啤酒酵母育种方面的应用。
　　1  基因工程技术
　　基因工程技术也称为DNA重组技术，是从生物体内提取出一定的DNA或人工合成DNA，把它和作为载体的质粒或噬菌体在体外重组，再转移到另一生物体内，从而改变生物的遗传性状。基因工程技术包括4个步骤：目的基因的获取;载体与工具酶的选择;DNA体外重组;外源基因的无性繁殖和表达。基因敲除技术又称基因打靶技术，将构建的打靶载体导入靶细胞后，通过载体DNA序列和靶细胞染色体的同源序列进行重组，将靶细胞基因组上的某一确定片段置换，使特定基因失活或缺失，从而改变细胞遗传特性[5]。
　　2  基因工程技术在啤酒酵母育种的应用
　　2.1 有效利用糊精
　　糖化过程中形成的高分子糊精不能被酵母利用，而葡萄糖苷酶能将其水解为葡萄糖，将葡萄糖苷酶的基因引入酵母中，可以有效利用麦芽汁中的糊精，改善啤酒的过滤性能，提高啤酒的发酵度。葡萄糖苷酶由同源基因STA1（DEX1）、STA2（DEX2）、STA3（DEX3）控制，能水解β-1，4糖苷键和β-1，6糖苷键，使糊精转化为葡萄糖。有报道显示克隆葡萄糖苷酶的酵母能水解麦芽汁中70%的糊精。
　　2.2 分解β-葡聚糖
　　β-葡聚糖的黏度很高，不利于麦芽汁和啤酒的过滤性能以及啤酒的风味稳定性。β-葡聚糖酶可以水解β-1，4和β-1，3葡萄糖苷键，将β-葡聚糖降解，从而降低醪液的黏度。含有细胞外β-葡聚糖基因的酵母能降解β-葡聚糖，改善啤酒的过滤性能。Meaden.P.G和PentJIia.M分别克隆了枯草芽孢杆菌和真菌的葡聚糖基因，并获得了具有葡聚糖分解能力的酵母，从而解决葡聚糖引起的浑浊问题。
　　2.3 降低双乙酰的生成量
　　双乙酰是啤酒发酵的副产物，对啤酒风味的影响很大，双乙酰含量的高低作为衡量啤酒是否成熟的指标（0.1 mg/L）。双乙酰是由丙酮酸在生物合成缬氨酸或异亮氨酸时，中间代谢产物α-乙酰乳酸转化得到的。双乙酰在酵母体内可被还原酶作用生成乙偶姻和2，3-丁二醇，或直接被α-乙酰乳酸脱羧酶作用快速生成乙偶姻。李艳等采用基因工程技术降低ILV2的活性，使α-乙酰乳酸生成量减少，缺失ILV2的酵母AHAS活性降低75%，双乙酰含量降低30%，其他发酵性能均为正常。Mithieux S等将ILV5在啤酒酵母中表达，RI活力可大幅度提高，利用此酵母发酵的啤酒，双乙酰含量降低50%，缩短了啤酒成熟的时间。Yamano S等将ALDC基因整合到酿酒酵母染色体上，用于啤酒的发酵可显著降低双乙酰的生成。用ILV5取代ILV2，降低AHAS的酶活力，减少α-乙酰乳酸生成量，并促进生成的α-乙酰乳酸转变为缬氨酸，从而降低双乙酰的生成量。也可通过结构类似物选育低α-乙酰乳酸合成酶活性或双乙酰还原能力强的抗性突变株，达到降低双乙酰的目的，但这种方法对降低双乙酰的程度有限。石婷婷等人采用PCR技术构建了BDH2基因整合过表达的重组酵母菌株B2Z，经啤酒发酵，BDH2基因的过表达使双乙酰的生成量降低，峰值和还原后的双乙酰分别降低42.61%和32.73%，其他指标基本符合啤酒发酵的要求[6]。 　　2.4 降低H2S的生成量
　　H2S是啤酒中主要的硫化物之一，影响啤酒的风味。主要在发酵过程中形成，酵母对半胱氨酸及硫酸盐和亚硫酸盐的同化作用及酵母合成蛋氨酸受抑制时的中间产物。可通过克隆NHS5基因，或将克隆MET25基因置于糖酵解启动子控制下，并将其整合到酵母的rDNA中，均可降低H2S的生成量。
　　2.5 降低高级醇的生成量
　　高级醇是在主发酵期间形成的，是啤酒的主要香味和口味物质之一，是3个碳以上的一元醇类物质的总称，包括正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇等。适量的高级醇能使酒体丰富，口味协调，给人以醇厚的感觉，但如果含量过高，会导致饮后上头并使啤酒有异味，应严格控制。高级醇产生途径，一方面来自于氨基酸转氨途径;另一方面来自于糖代谢途径，α-酮酸由葡萄糖经EMP途径和TCA循环合成。A.Eden等人发现异戊醇、活性戊醇和异丁醇受ecaΔ39、ecaΔ40的影响显著，BCAT可切断或减弱氨基酸转变成α-酮酸的能力，減少缬氨酸到异丁醇、亮氨酸到异戊醇的产生。Dickenson等人的研究显示，从缬氨酸到异丁醇的代谢途径中，丙酮酸脱羧酶是合成异丁醇的关键步骤，通过构建丙酮酸脱羧酶活性降低的工程菌可降低异丁醇的生成量。正丙醇由α-酮丁酸进一步脱羧脱氢生产成，丙酮酸在合成缬氨酸的过程中会生产异丁醇的前体物质α-酮异戊酸[7]，其能被异丙基苹果酸合成酶催化生成异戊醇的前体物质α-酮异己酸[8]。石钰[9]等人通过构建重组质粒pUC-LABK，获得LA-KanMX-LB重组盒，并利用醋酸锂转化法和同源重组技术，筛选出LEU1基因缺失的突变株A-L9，两种发酵条件下，异戊醇的生成量分别降低了0.29倍和0.51倍。
　　2.6 解决醇高酯低的问题
　　啤酒发酵的副产物中，乙酸乙酯和高级醇是影响啤酒风味的重要物质，葛峻伶等人通过对BAT2基因和Lg-ATF1基因的研究[10]，解决啤酒酿造过程中醇类和酯类的生成量的问题。BAT2基因影响高级醇的生成量，Lg-ATF1基因影响乙酸乙酯的生成量，通过酶切连接法重组质粒pUC-PLABBK，获得重组菌株S5-Lg，过表达Lg-ATF1基因，并敲除BAT2基因，经过发酵后，重组菌株S5-Lg的高级醇降低9.12%，乙酸乙酯升高26.81%。菌株S5-Lg与原菌株S5的生长性能和发酵性能基本保持一致。
　　2.7 发酵性能的改良
　　啤酒酿造过程中，酵母凝聚的好坏是至关重要的[11]。絮凝性是啤酒酵母的重要特性之一，良好的絮凝性能使酵母在啤酒发酵后快速沉淀到发酵罐底部，既能降低分离酵母所需的能源，也能避免酵母不及时沉淀，而悬浮在发酵液中造成的酵母自溶现象，并能使啤酒发酵顺利进行。在啤酒发酵中使用高PYF活力水平的麦芽时，酵母便会提前絮凝，该现象对啤酒酿造产生不利影响，应设法避免。絮凝是酵母自我保护的方式，在不利环境中，酵母的絮凝可使其避免受到各种因素的胁迫，絮凝基因的改变会影响酵母对抗逆境的能力。李静怡等人利用PCR介导基因中断技术，以pUG6为模板，设计含有与flo8基因两侧序列同源的引物，构建带有KanMX基因的中断盒，醋酸锂法转化啤酒酵母G-03，转化啤酒酵母，使基因片段同源重组，敲除FLO8基因，会有所削弱啤酒酵母的絮凝力，从而削弱提前絮凝因子对酵母的作用，在高PYF值麦芽汁中发酵能保持很好的发酵性能。
　　2.8 高温高浓发酵菌种的构建
　　啤酒酿造通常采用低温发酵，而高温高浓发酵将给啤酒生产企业带来利益，但会存在酵母回收问题、副产物高级醇生成量过高问题等。孙中贯等人通过以BAT2基因为整合位点过表达FLO5基因构建了酵母菌株[12]，啤酒酵母的凝聚性达到85.44%，与出发菌株相比，提高了63%，通过弱化线粒体支链氨基酸转氨酶（BAT1）的表达，高级醇生成量为142.13 mg/L，降低了18.4%。BAT基因与FLO5基因在改造过程中，不存在互相干扰或协同的现象。通过对FLO5基因和BAT基因的遗传改造，提高了啤酒酵母高温高浓发酵的凝聚性能，并降低了高级醇的生成量，此研究对啤酒发酵后酵母的回收及啤酒风味有重要意义。
　　2.9 抗自溶啤酒酵母菌种的选育
　　啤酒酵母的自溶会影响啤酒的品质，王金晶等人在啤酒酵母自溶的研究中发现，细胞完整性途径中，RLM1基因作为重要的转录因子，与酵母的自溶性有密切的关系[13]。将RLM1基因敲除后，啤酒酵母的抗自溶性会变差，并影响酵母的抗渗透压性能，使细胞壁损伤的耐受性、抗氮饥饿性能和温度耐受性;而RLM1基因过表达则会有助于啤酒酵母的抗自溶。因此，基于同源重组的方法对RLM1基因进行敲除和过表达，获得重组菌H-rlm1Δ和H-rlm1，啤酒酵母对细胞壁损伤、氮饥饿、渗透压的耐受性以及温度的敏感性都受到了影响。通过对RLM1基因的调控，对酵母的抗自溶能力产生影响，为啤酒酵母抗自溶能力菌株的选育提供依据。
　　3  结语
　　利用DNA重组技术进行啤酒酵母的育种是目前广泛使用的方法，在基因工程菌种构建的过程中，外源基因应尽可能少，而且其表达一定不能影响到酵母的发酵性能;所用的目的基因需确认是无毒的酵母菌株。利用DNA重组技术对啤酒酵母定向育种，将会获得更优质的啤酒酵母，酿造出质量更好、风味更佳的啤酒。
　　参考文献
　　[1] 张娇，吴献华，荆通，等.啤酒酵母目的基因的提取[J].中外酒业·啤酒科技，2018（23）：47-49.
　　[2] 杨静静.抗老化啤酒酵母研究进展[J].生物工程学报，2017，33（4）：541-551.
　　[3] 王金晶，杨静静，丁华建，等.啤酒发酵过程中酵母环境压力应答机制研究进展[J].食品与发酵工业，2017（1）：266-270，275.
　　[4] 尹花，贺扬，候晓平，等.Lager啤酒酵母起源的历史足迹及基因组学研究[J].食品与发酵工业，2019（9）：274-281.
　　[5] 李燕，戴佳锟，甄丽莎，等.发酵工业菌种改良中的基因敲除策略及应用[J].中国酿造，2013，32（1）：5-7.
　　[6] 石婷婷，李凭，肖冬光，等.BDH2基因过表达对啤酒酵母双乙酰代谢的影响[J].食品与发酵工业，2016（2）：13-17.
　　[7] chen xiao，kristian f nielsen，lrina borodina，et al.Incrcased isobutanol production in Saccharomyces cerevisiae by overexpession of genes in valine metabolism[J].Biotechnol Biofuels，2011（4）：21.
　　[8] 佐一含.LEU2基因敲除对工业啤酒酵母高级醇生成量的影响[J].中国酿造，2011（3）：27-30.
　　[9] 石钰，陈叶福，肖冬光，等.LEU1基因缺失对酿酒酵母高级醇生成量的影响[J].酿酒科技，2015（2）：12-16.
　　[10] 葛峻伶，郭莹，刘小二，等.一次敲除BAT2同时过表达Lg-ATF1对啤酒酵母产醇酯的影响[J].现代食品科技，2019，35（6）：171-176，272.
　　[11] 张建早，郑良军，程丽仙，等.浅析啤酒酵母絮凝性的影响因素[J].中外酒业·啤酒科技，2016（19）：41-43.
　　[12] 孙中贯，周波，王孟祺，等.高温高浓发酵工业啤酒酵母菌种的构建[J].生物工程学报，2019，35（3）：522-534.
　　[13] 王金晶，李孟琦，候丹，等.Lager啤酒酵母RLM1基因调控对其抗自溶性能的影响[J].生物工程学报，2019，35（6）：1059-1070.
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