不同中药对NaV1.7离子通道的抑制率比较

来源:用户上传      作者:申小年 彭俊宇 戴俭华

　　摘  要：目的  分别用NaV1.7离子通道测试的常用中药的抑制率，比较这些常用药物的疗效，为临床处方治疗疼痛提供理论指导。方法  选择三七、天麻、全蝎、蘄蛇各20 g，根据2015版中药药典通则2201的40 g对应1 000 mL水的方法，冷凝水煎提取。然后过0.22 μm滤膜，使用全细胞膜片钳技术，研究这些药物分别对NaV1.7离子通道抑制作用。结果  抑制率的比较的结果：三七的抑制率最高，临床有统计学意义。结论 对于临床骨科常用药物止痛效果有一定的指导意义。
　　关键词：疼痛  膜片钳  离子通道  中药镇痛
　　中图分类号：R73            文献标识码：A               文章编号：1672-3791（2021）01（a）-0250-03
　　Comparison of Inhibition Rates of Different Traditional Chinese Medicine on Nav1.7 Ion Channel
　　SHEN Xiaonian1  PENG Junyu2  DAI Jianhua2
　　（1.Anhui College of Traditional Chinese Medicine; 2. Anhui Wuhu Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Anhui College of Traditional Chinese Medicine， Wuhu， Anhui Province， 241000 China）
　　Abstract： Objective The inhibition rates of commonly used traditional Chinese medicines tested with NaV1.7 ion channels were compared， and the therapeutic effects of these commonly used medicines were compared to provide theoretical guidance for the clinical prescription of pain. Methods 20 g each of Panax notoginseng， Gastrodia elata， whole scorpion， and cypris were selected. According to the method of 2015 edition of the General Principles of Chinese Medicine Pharmacopoeia 2201， 40 g corresponded to 1 000 mL of water，condensate decoction extraction. Then through a 0.22 μm filter， using whole-cell patch-clamp technology to study the inhibitory effects of these drugs on NaV1.7 ion channels. Results  The result of the comparison of the inhibition rate： Panax notoginseng has the highest inhibition rate， which is statistically significant. Conclusion It has certain guiding significance for the analgesic effect of commonly used drugs in clinical orthopedics.
　　Key Words： Pain; Patch clamp; Ion channel; Analgesia with traditional Chinese medicine
　　疼痛是一种在躯体或内脏组织中产生的具有潜在伤害性或受到有害刺激之后的令人不快的感觉。炎症和神经性疼痛与急性疼痛不同，如关节炎和偏头痛，在大部分人身上往往表现出的是持久的慢性状态，医疗保健费用花费达数十亿美金并且造成生产力损失[1]。钠离子通道的表达异常可能与炎性痛、神经病理性痛和癌痛等多种慢性痛的发病机制相关[2]。电压门控钠通道是完整的跨膜蛋白，为兴奋性细胞的快速去极化提供电流通路，并且它们在传递伤害感受器对背角突触的反应中起关键作用[3]。NaV1.7离子通道主要集中分布于感觉神经的背根神经节和交感神经的神经节中，同时也分布于伤害性刺激密切相关的传入神经纤维Aβ纤维和C纤维中表达[4]。
　　近年来，基于几项显著的人类遗传学研究，NaV1.7已成为一种极有研究价值的镇痛靶点。调控编码NaV1.7α亚基基因为SCN9A，研究指出SCN9A基因不同位点突变导致了疼痛相关疾病的发生：如红斑性肢痛症（Inherited Erythro Melalgia，IEM）、先天性无痛症（Congenital Insensitivity to Pain，CIP）和阵发性剧痛症（Paroxysmal Extreme Pain Disorder，PEPD）。特异性NaV1.7阻断剂是当前靶向钠通道的镇痛药物研发的热点。 　　药物治疗为神经病理性疼痛的主要治疗方案之一，但不良反应使其在临床应用中受到一定限制。因此寻找新的药物治疗思路显得尤为重要。临床上中医药的止痛使用范围极为广泛，但是一直没有一个统一的检测衡量标准，通过该实验希望能够建立一种检测标准使中药止痛的疗效有一个比较，指导临床使用中药。
　　1  材料和方法
　　1.1 水提液的制备
　　精密称量三七、天麻、全蝎、蕲蛇各20 g，浓度按40 g药物/1 000 mL超蒸水进行提取，冷浸60 min，在115 ℃下冷凝提取，热煮沸60 min，浓缩液约为500 mL。将液袋封放置于冰箱在-20 ℃下储存冷藏室待用。用时用滤网（0.22 μm）的滤器储备溶液浓度分别为0.1 g/mL和0.25 g/mL。
　　1.2 细胞培养
　　NaV1.7通道稳定表达在人胚肾（HEK 293）细胞上，NaV1.7通道（山东维真生物医药科技有限公司，济南，中国）分别生长于DMEM（DMEM，Gibco，USA），100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素和400 μg/mL G418（Sigma-Aldrich，USA）的培养基，且放置在37 ℃，5%CO2培養箱中进行培养。用胰蛋白酶溶液消化细胞，然后在膜片钳实验前将细胞接种在无菌玻璃盖玻片上12～36 h。
　　1.3 全细胞膜片钳记录
　　用于NaV通道记录的标准浴液包含：70 mM NaCl、1 mM MgCl2、4 mM CsCl、10 mM葡萄糖、10 mM HEPES、1.8 mM CaCl2、用NaOH将pH调节至7.4，用蔗糖将摩尔渗透压浓度调节至300 mOsm。用于NaV通道记录的标准电极内液包含40 mM CsCl、100 mM CsF、2 mM MgCl2、5 mM EGTA、10 mM HEPES，用CsOH将pH调节至7.4，用蔗糖将溶液摩尔渗透压浓度调节至300 mOsm。
　　2  数据分析
　　使用Clampfit（Axon，USA）软件对电流进行分析。通过使用非线性回归方程分析拟合到模式方程的数据（SSPS）。组数据表示为平均值±标准差（），使用单样本t检验统计学比较。P<0.05被认为具有统计学意义。
　　Fig.1.抑制率比较：抑制率均值单样本t检验，（P=0.018），P<0.05。抑制率的比较的结果：三七的抑制率最高，临床有统计学意义。三七对NaV1.7离子通道的抑制率比天麻、全蝎、蕲蛇更有效。
　　3  讨论
　　神经病理性疼痛的病理生理机制复杂，现代研究认为主要是外周敏化（Peripheral Sensitization）和中枢敏化（Central Sensitization）引起疼痛。现在对于神经病理性疼痛的发病机制主要是通过动物模型进行研究。动物实验为理解人类神经病理性疼痛提供了非常有价值的工具。常见的动物模型有坐骨神经慢性压迫（Chronic Constriction Injury， CCI）模型、坐骨神经分支选择损伤（Spared Nerve Injury， SNI）模型、背根神经节慢性压迫（Chronic Compression of Dorsal Root Ganglion， CCD）模型、坐骨神经部分结扎（Partial Sciatic Nerve Injury， PSNI）模型、脊神经结扎（Spinal Nerve Ligation， SNL）模型。这些动物模型可表现痛觉过敏、痛觉异常以及自发痛等NP症状，主要通过机械刺激痛、热刺激痛和冷刺激痛确定模型是否成功。电压门控钠（NaV）通道是完整的跨膜蛋白，为可兴奋细胞的快速去极化提供电流通路，并且它们在传递伤害感受器对背角突触的反应中起关键作用。特异性NaV1.7阻断剂是当前靶向钠通道的镇痛药物研发的热点。通过该研究发现，三七在这几味中药中对NaV1.7离子通道抑制率最高，有统计学意义;表明三七比天麻、全蝎和蕲蛇在疼痛的止痛方面更有效果;进一步解释了三七止痛是抑制了对NaV1.7离子通道的抑制，提供了临床三七止痛的药理基础。还需要进一步研究三七止痛的主要成份和量效关系。
　　参考文献
　　[1] Steven J McKerrall，DanieL P Sutherlin. Nav1.7 inhibitors for the treatment of chronic pain[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2018，28（19）：3141-3149.
　　[2] Waxman SG. Transcriptional channelopathies： an emerging class of disorders[J].Nature Reviews Neuroscience，2017，2（9）：652-659.
　　[3] Ednard Emery， Ana Paula Luiz， John N Wood. Nav1.7 and other voltage-gated sodium channels as drug targets for pain relief[J].Expert Opin Ther Targets，2016，20（8）：975-983.
　　[4] Hoeijmakers JGJ， Merkies ISJ， Gerrits MM， et al. Genetic aspects of sodium channelopathy in small fiber neuropathy[J].Clin Genet，2018，82（4）：351-358.
　　[5] 岳子皓.糖皮质激素受体调节钠离子通道Nav1.7参与神经病理性疼痛[D].郑州大学，2016.
　　[6] 宋珍源.电压门控性钠离子通道NaV1.7和NaV1.8参与糖尿病大鼠肠道痛觉过敏的外周机制研究[D].苏州大学，2015.
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